Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano
Summary
Aqui, apresentamos um método versátil para transformação da raiz do tomate seguido de inoculação com Ralstonia solanacearum para realizar análise genética simples para o estudo da doença de murcha bacteriana.
Abstract
Ralstonia solanacearum é um patógeno vascular devastador que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, causando uma importante ameaça à agricultura. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos bacterianos vegetais, como pseudomonas singae em Arabidopsis. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação em plantas hospedeiras nativas. Nesse cenário, desenvolvemos um método para realizar a análise genética da infecção por Ralstonia do tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia. Este método baseia-se na transformação mediada do Agrobacterium rhizogenesdas raízes do tomate, seguida pela inoculação de ralstonia encharcada de solo das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi. Como prova de conceito, utilizou-se este método para mostrar que o silenciamento mediado pela RNAI de Sisa6 nas raízes do tomate conferiu resistência à Ralstonia. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.
Introduction
Ralstonia solanacearum, o agente causal da doença da murcha bacteriana, é um patógeno vascular devastador do solo com uma distribuição mundial que pode infectar uma grande variedade de espécies vegetais, incluindo batata, tomate, tabaco, banana, pimenta e berinjela, entre outras1,2. As perdas de rendimento causadas pela Ralstonia podem chegar a 80-90% da produção em tomate, batata ou banana, dependendo da cultivar, clima, solo e outros fatores3. No entanto, o modelo de Ralstonia é consideravelmente pouco explorado em comparação com outros modelos envolvendo patógenos de plantas bacterianas, tais como Pseudomonas singae ou Xanthomonas spp. Além disso, a maioria dos estudos em interações entre plantas e micróbios está focada na planta modelo Arabidopsis thaliana. Embora a pesquisa que utiliza esses modelos tenha contribuído em grande parte para a nossa compreensão das interações entre plantas e bactérias, elas não abordam a necessidade atual de entender essas interações nas plantas agrícolas. Pesquisas voltadas para a compreensão da interação entre ralstonia e plantas agrícolas são essenciais para desenvolver soluções sustentáveis para combater a doença bacteriana, mas atualmente é dificultada pela falta de ensaios experimentais simples para caracterizar os diferentes componentes da interação. Particularmente, o tomate, um hospedeiro natural da Ralstonia,é a segunda cultura vegetal mais importante do mundo e é afetado por uma infinidade de doenças4, incluindo a doença de murcha bacteriana. Neste trabalho, desenvolvemos um método fácil para realizar análisegenética da infecção por Ralstonia do tomate. Este método baseia-se na transformação mediada de raízes de tomate da Agrobacterium,utilizando fluorescência DsRed como marcador de seleção5,seguida pela inoculação de drenagem do solo de Ralstonia das plantas resultantes, contendo raízes transformadas expressando a construção de interesse. A versatilidade do ensaio de transformação raiz permite realizar a superexpressão genética ou o silenciamento genético mediado pela RNAi.
Uma limitação potencial deste método consiste no crescimento residual de raízes não transformadas. Isso é particularmente importante nos casos em que o plasmídeo utilizado carece de um gene de repórter que permita a seleção de raízes transformadas. Para resolver esse problema, desenvolvemos um método alternativo baseado na seleção de antibióticos, que inibe o crescimento de raízes não transformadas, permitindo ao mesmo tempo o crescimento de raízes transformadas saudáveis resistentes a antibióticos. Uma vez que A. rizógenes não induz a transformação de brotos, eles são suscetíveis ao antibiótico e, portanto, devem ser mantidos separados do meio contendo antibióticos.
Embora a resistência vegetal contra a Ralstonia não seja bem compreendida, vários relatos associaram alterações na parede celular ao aumento da resistência à murcha bacteriana6,,7,,8,9. Sugere-se que essas alterações na parede celular afetem o desenvolvimento vascular, aspecto essencial para o estilo de vida da Ralstonia dentro da planta10. Mutações nos genes que codificam os sintetizadores de celulose CESA4, CESA7 e CESA8 em Arabidopsis thaliana têm sido demonstradas para prejudicar a integridade da parede celular secundária, causando maior resistência à Ralstonia,que parece estar ligada à sinalização ABA8. Portanto, como prova de conceito para o nosso método, realizamos o silenciamento genético mediado pela RNAi de SlCESA6 (Solyc02g072240), um sintetizador secundário de celulose de parede celular, e ortolog de AtCESA8 (At4g18780). A inoculação subseqüente de drenagem do solo com ralstonia mostrou que silenciar SlCESA6 aumentou a resistência aos sintomas de murcha bacteriana, sugerindo que a resistência mediada pela parede celular à Ralstonia é provavelmente conservada no tomate, e validando nosso método para realizar análise genética da resistência bacteriana murcha nas raízes do tomate. Aqui, descrevemos este método em detalhes, permitindo abordagens genéticas para entender a doença de murcha bacteriana em um tempo relativamente curto e com pequenas exigências de equipamentos e espaço de crescimento vegetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum representa uma ameaça importante para a agricultura; no entanto, sua interação com hospedeiros naturais de importância agrícola ainda é pouco compreendida em comparação com outros patógenos bacterianos, especialmente em espécies de plantas agrícolas. Na maioria dos casos, a análise genética é dificultada pelo tempo e gastos necessários para modificar geneticamente plantas hospedeiras. Para enfrentar esse problema e facilitar a análise genética da infecção por R. sola…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros do laboratório macho por discussões úteis, Alvaro López-García por aconselhamento estatístico, e Xinyu Jian por assistência técnica e administrativa durante este trabalho. Agradecemos ao núcleo de Biologia Celular do PSC pela assistência com imagens de fluorescência Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (bolsa XDB27040204), o Centro de Biologia do Estresse Vegetal de Xangai (chinês Academia de Ciências) e o programa chinês 1000 Talentos.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Referências
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