إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان
Summary
أورام الغدد الصماء العصبية (الناموسيات) تنشا من خلايا الغدد الصماء العصبية. فهي بطيئه النمو وتحديا للثقافة. نحن نقدم استراتيجية بديله لزراعه الشباك من الأمعاء الصغيرة عن طريق الخياطة لهم كما خزان. هذه الخزان لديها علامات الأمعاء الصغيرة NET ويمكن استخدامها لاختبار المخدرات.
Abstract
أورام الغدد الصماء العصبية الصغيرة (SBNETsات) هي سرطانات نادره منشؤها خلايا enterochromaffinه من الأمعاء. وقد كان البحث في هذا المجال محدودا لأنه تم إنشاء عدد قليل جدا من خطوط الخلايا SBNET المستمدة من المريض. خلايا SBNET المتمايزة بشكل جيد بطيئه النمو ويصعب نشرها. والخطوط الخلوية القليلة التي أنشئت ليست متاحه بسهوله ، وبعد وقت في الثقافة قد لا تستمر في التعبير عن خصائص الخلايا NET. توليد خطوط الخلايا الجديدة قد يستغرق سنوات عديده منذ الخلايا SBNET لديها وقت مضاعفه طويلة وهناك حاجه إلى العديد من الخطوات الإثراء من أجل القضاء علي الأورام الليفية المرتبطة بالسرطان بسرعة الانقسام. للتغلب علي هذه القيود ، قمنا بتطوير بروتوكول للثقافة SBNET الخلايا من الأورام المزالة جراحيا كما خزان في مصفوفة خارج الخلية (ECM). يشكل ECM مصفوفة ثلاثية الابعاد تغلف خلايا SBNET وتحاكي البيئة الصغرى للورم للسماح لخلايا SBNET بالنمو. هنا ، ونحن ميزت معدل النمو من SBNET خزان ووصفت طرق لتحديد علامات SBNET باستخدام المجهر المناعي ومناعي للتاكد من ان الخزان هي خلايا الورم الغدد الصماء العصبية. الاضافه إلى ذلك ، استخدمنا SBNET خزان لاختبار السمية الخلوية من rapamycin.
Introduction
الأورام العصبية المعوية الصغيرة (سبنتس) تنشا من خلايا enterochromaffinه من الأمعاء الصغيرة. علي الرغم من انه من المعروف عموما SBNETs تنمو ببطء, انها تنتشر عاده إلى الكبد1. في حين يمكن النظر في أزاله الجراحية أو استئصال الورم في كثير من الحالات ، وتكرار يكاد يكون عالميا ، التالي ، العلاج الطبي يلعب دورا هاما في الاداره. وقد استثمرت جهود هائله لتوليد خطوط خلوية جديده SBNET لاختبار المخدرات. ومع ذلك ، لم يكن هناك نجاح يذكر. فقط 6 خطوط الخلايا sbnet (krj-I, CND2, GOT1, ف-sts, L-sts, H-sts) وقد تم الإبلاغ عن2,3,4,5; وللاسف خط خليه واحده لم يعد يعبر عن علامات NET6 وثلاثه أخرى خطوط الخلية sbnet (krj-I ، L-Sts ، H-sts) كانت مصممه علي ان تستمد من الليمفاوية تحولت بدلا من الشباك7. وللتعجيل بتحديد الادويه اللازمة لاستهداف الشبكات الكهربائية الخاصة ، هناك حاجه إلى أساليب بديله لاختبار المخدرات في المختبر.
هنا ، ونحن نستفيد من توافر SBNETsات وانشات وسيله للثقافة هذه SBNETs المستمدة من المريض كما خزان النمو في ECM. الهدف العام لهذه المخطوطة هو وصف طريقه للثقافة SBNET كثقافة ثلاثية الابعاد (3D) والخطوط العريضة الإجراءات لتوصيف هذه الخزان للاحتفاظ بعلامات SBNET عن طريق تلطيخ المناعي والمناعي.
الاضافه إلى ذلك ، فاننا نظهر كيف يمكن استخدام هذه SBNET خزان لاختبار تاثير rapamycin ، وهو دواء مضاد للسرطان لشبكات8. الأساس المنطقي وراء هذا البروتوكول هو تطوير طريقه جديده لزراعه خلايا SBNET في المختبر واستخدامها لاختبار المخدرات. الميزة من هذا تقنيه علي الطريقة تقليديه من يؤسس [سبنت] خليه خط ان ثقافات [3 د] من [سبنتس] يستطيع بسرعة كنت نلت واختبار المخدر يستطيع كنت أنجزت ضمن 3 أسابيع. ويمكن استخدام SBNET خزان كنموذج لأداء في شاشات المخدرات في المختبر لتحديد الادويه الجديدة للمرضي SBNET. منذ خطوط الخلايا SBNET ليست متاحه علي نطاق واسع ، والثقافات 3D من خزان SBNET يمكن ان تكون بمثابه نموذج جديد في المختبر لدراسة Sbnetات ويمكن تقاسمها بين العلماء في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبحت الثقافات الورم 3D موردا قيما لاختبار المخدرات قبل السريرية15. وقد أنشئت في الاونه الاخيره الأورام العضوية المختلفة بيوانكات من سرطان الثدي وأورام سرطان البروستاتا16,17. في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا للثقافة SBNET كما خزان وطريقه ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح P50 CA174521 (إلى J.R. هاو و ص Bellizzi). عدسه P.H. الاذن هو المتلقي لجائزه برنامج تعزيز الحياة المهنية P50 CA174521.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
