Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin
Summary
Les tumeurs neuroendocrines (NET) proviennent des cellules neuroendocrines de la crête neurale. Ils sont à croissance lente et difficiles à la culture. Nous présentons une stratégie alternative pour cultiver des NETs des petites entrailles en les cultivant en tant que sphéroïdes. Ces sphéroïdes ont de petits marqueurs NET intestin et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues.
Abstract
Les tumeurs neuroendocrines de petite entrailles (SBNETs) sont des cancers rares provenant des cellules d’entéroochromaffin de l’intestin. La recherche dans ce domaine a été limitée parce que très peu de lignées cellulaires SBNET dérivées de patients ont été générées. Les cellules SBNET bien différenciées se développent lentement et sont difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires qui ont été établies ne sont pas facilement disponibles, et après le temps dans la culture peut ne pas continuer à exprimer des caractéristiques des cellules NET. La génération de nouvelles lignées cellulaires pourrait prendre de nombreuses années puisque les cellules SBNET ont un long temps de doublement et de nombreuses étapes d’enrichissement sont nécessaires afin d’éliminer les fibroblastes rapidement associés au cancer. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un protocole à la culture des cellules de SBNET des tumeurs chirurgicalement enlevées comme sphéroïdes dans la matrice extracellulaire (ECM). L’ECM forme une matrice tridimensionnelle qui encapsule les cellules SBNET et imite le micro-environnement tumoral pour permettre aux cellules SBNET de se développer. Ici, nous avons caractérisé le taux de croissance des sphéroïdes de SBNET et décrit des méthodes pour identifier des marqueurs de SBNET utilisant la microscopie et l’immunohistochimie d’immunofluorescence pour confirmer que les sphéroïdes sont des cellules neuroendocrines de tumeur. En outre, nous avons utilisé des sphéroïdes SBNET pour tester la cytotoxicité de la rapamycine.
Introduction
Les petites tumeurs neuroendocrines d’entrailles (SBNETs) proviennent des cellules d’entérosochromaffin du petit intestin. Bien que les SBNETs soient généralement connus pour se développer lentement, ils métastasent généralement au foie1. Tandis que le déplacement chirurgical ou l’ablation de tumeur peut être considéré dans beaucoup de cas, la répétition est presque universelle, et, par conséquent, la thérapie médicale joue un rôle important dans la gestion. D’énormes efforts ont été investis pour générer de nouvelles lignées cellulaires SBNET pour le dépistage des drogues. Cependant, il y a eu très peu de succès. Seules 6 lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) ont été signalées2,3,4,5; et malheureusement, une lignée cellulaire n’exprime plus de marqueurs NET6 et trois autres lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) ont été déterminées à provenir de lymphoblastes transformés au lieu de NETs7. Afin d’accélérer l’identification des médicaments pour cibler les SBNET, d’autres méthodes de dépistage in vitro des drogues sont nécessaires.
Ici, nous profitons de la disponibilité des SBNETs réséqués et avons établi un moyen de cultiver ces SBNETs dérivés du patient comme des sphéroïdes de plus en plus en ECM. L’objectif global de ce manuscrit est de décrire une méthode de culture SBNET comme une culture tridimensionnelle (3D) et des procédures de contour pour caractériser ces sphéroïdes pour la rétention des marqueurs SBNET par la coloration immunofluorescence et l’immunohistochimie.
En outre, nous démontrons comment ces sphéroïdes SBNET peuvent être utilisés pour tester l’effet de la rapamycine, un médicament anticancéreux pour lesNET8. La raison d’être de ce protocole est de développer une nouvelle méthode pour cultiver les cellules SBNET in vitro et de les utiliser pour le dépistage des drogues. L’avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d’établissement d’une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D des SBNETs peuvent être rapidement obtenues et que des tests de dépistage de drogues peuvent être effectués dans les 3 semaines. Les sphéroïdes SBNET pourraient potentiellement être utilisés comme modèle pour effectuer des écrans de médicaments in vitro afin d’identifier de nouveaux médicaments pour les patients atteints de SBNET. Étant donné que les lignées cellulaires SBNET ne sont pas largement disponibles, les cultures 3D des sphéroïdes SBNET peuvent servir de nouveau modèle in vitro pour l’étude des SBNETs et peuvent être partagées entre les scientifiques dans le domaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cultures 3D tumorales sont devenues une ressource précieuse pour les tests précliniques15. Diverses biobanques organoïdes tumorales ont récemment été établies à partir du cancer du sein et des tumeurs du cancer de la prostate16,17. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé à la culture SBNET comme sphéroïdes et une méthode simple et rapide pour valider les cultures sphéroïdes pour les marqueurs NET par i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH P50 CA174521 (à J.R. Howe et A.M. Bellizzi). P.H. Ear est récipiendaire du prix P50 CA174521 Du Programme d’amélioration de carrière.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
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