Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden
Summary
Neuroendokrine Tumoren (NETs) stammen aus neuroendokrinen Zellen des Neuralkamms. Sie sind langsam wachsend und herausfordernd für die Kultur. Wir präsentieren eine alternative Strategie, um NETs aus dem kleinen Darm zu züchten, indem wir sie als Sphäroide kultivieren. Diese Sphäroide haben kleine Darm-NET-Marker und können für Drogentests verwendet werden.
Abstract
Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) sind seltene Krebsarten, die aus Enterochromaffinzellen des Darms stammen. Die Forschung auf diesem Gebiet war begrenzt, da nur sehr wenige von Patienten abgeleitete SBNET-Zelllinien erzeugt wurden. Gut differenzierte SBNET-Zellen wachsen langsam und sind schwer zu vermehren. Die wenigen Zellenlinien, die festgelegt wurden, sind nicht ohne weiteres verfügbar, und nach der Zeit in der Kultur können die Eigenschaften von NET-Zellen nicht mehr zum Ausdruck kommen. Die Erzeugung neuer Zelllinien könnte viele Jahre dauern, da SBNET-Zellen eine lange Verdoppelungszeit haben und viele Anreicherungsschritte erforderlich sind, um die sich schnell trennenden krebsassoziierten Fibroblasten zu beseitigen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, um SBNET-Zellen aus chirurgisch entfernten Tumoren als Sphäroide in extrazellulärer Matrix (ECM) zu kultiieren. Das ECM bildet eine dreidimensionale Matrix, die SBNET-Zellen kapselt und die Tumor-Mikroumgebung imitiert, um SBNET-Zellen wachsen zu lassen. Hier charakterisierten wir die Wachstumsrate von SBNET Sphäroiden und beschriebene Methoden zur Identifizierung von SBNET-Markern mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Immunhistochemie, um zu bestätigen, dass es sich bei den Sphäroiden um neuroendokrine Tumorzellen handelt. Darüber hinaus verwendeten wir SBNET Sphäroide zur Prüfung der Zytotoxizität von Rapamycin.
Introduction
Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) stammen aus Enterochromaffinzellen des Dünndarms. Obwohl SBNETs allgemein dafür bekannt sind, langsam zu wachsen, metastasieren sie häufig zur Leber1. Während die chirurgische Entfernung oder Tumorablation in vielen Fällen in Betracht gezogen werden kann, ist das Wiederauftreten fast universell, und daher spielt die medizinische Therapie eine wichtige Rolle im Management. Es wurden enorme Anstrengungen unternommen, um neue SBNET-Zelllinien für Arzneimitteltests zu generieren. Es gab jedoch nur sehr wenig Erfolg. Es wurdennur6 SBNET-Zelllinien (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) gemeldet 2,3,4,5; und leider drückt eine Zelllinie nicht mehr die NET-Marker6 aus und drei weitere SBNET-Zelllinien (KRJ-I, L-STS, H-STS) wurden bestimmt, aus transformierten Lymphoblasten anstelle von NETs7abgeleitet zu werden. Um die Identifizierung von Arzneimitteln für SBNETs zu beschleunigen, sind alternative Methoden für In-vitro-Arzneimitteltests erforderlich.
Hier nutzen wir die Verfügbarkeit von resezierten SBNETs und haben einen Weg etabliert, diese patientenabgeleiteten SBNETs als Sphäroide zu kultitonischen, die in ECM wachsen. Das übergeordnete Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Kultur von SBNET als dreidimensionale (3D) Kultur und Umrissverfahren zu beschreiben, um diese Sphäroide zur Beibehaltung von SBNET-Markern durch Immunfluoreszenzfärbung und Immunhistochemie zu charakterisieren.
Darüber hinaus zeigen wir, wie diese SBNET Sphäroide verwendet werden können, um die Wirkung von Rapamycin, einem Krebsmedikament für NETs8,zu testen. Der Grund für dieses Protokoll ist die Entwicklung einer neuen Methode, um SBNET-Zellen in vitro zu züchten und für Arzneimitteltests zu verwenden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber der traditionellen Methode zur Festlegung einer SBNET-Zelllinie besteht darin, dass 3D-Kulturen von SBNETs schnell gewonnen werden können und Arzneimitteltests innerhalb von 3 Wochen durchgeführt werden können. SBNET Sphäroide könnten möglicherweise als Modell für die Durchführung von In-vitro-Medikamentenscreens verwendet werden, um neue Medikamente für SBNET-Patienten zu identifizieren. Da SBNET-Zelllinien nicht weit verbreitet sind, können 3D-Kulturen von SBNET-Sphäroiden als neues In-vitro-Modell für die Untersuchung von SBNETs dienen und unter Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geteilt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor-3D-Kulturen sind zu einer wertvollen Ressource für präklinische Arzneimitteltests geworden15. Verschiedene Tumororganoid-Biobanken wurden vor kurzem aus Brustkrebs und Prostatakrebs Tumoren16,17etabliert. In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur SBNET als Sphäroide und eine einfache und schnelle Methode, um die Sphäroidkulturen für NET-Marker durch Immunfluoreszenz zu validieren und die Wirkstoffempfind…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien P50 CA174521 (an J.R. Howe und A.M. Bellizzi) unterstützt. P.H. Ear ist Träger des P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
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