स्थापना और छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर Spheroids की विशेषता
Summary
न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर (एनटीएस) तंत्रिका शिखर की न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाओं से उत्पन्न होता है। वे धीमी गति से बढ़ रही है और संस्कृति के लिए चुनौतीपूर्ण हैं. हम उन्हें गोलोइड के रूप में culturing द्वारा छोटे आंत्र से NETs विकसित करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रस्तुत करते हैं। इन गोलिभदों छोटे आंत्र नेट मार्करों है और दवा परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर (SBNETs) पेट के आंत्ररोमाफिन कोशिकाओं से उत्पन्न दुर्लभ कैंसर हैं. इस क्षेत्र में अनुसंधान सीमित किया गया है क्योंकि बहुत कम रोगी व्युत्पन्न SBNET सेल लाइनों उत्पन्न किया गया है. अच्छी तरह से अलग SBNET कोशिकाओं धीमी गति से बढ़ रहे हैं और प्रचार करने के लिए कठिन हैं. कुछ कक्ष पंक्तियाँ स्थापित किया गया है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, और संस्कृति में समय के बाद NET कक्षों की विशेषताओं को व्यक्त करने के लिए जारी नहीं हो सकता है। नई सेल लाइनों उत्पन्न कई साल लग सकता है के बाद से SBNET कोशिकाओं को एक लंबे समय से दोहरीकरण समय है और कई संवर्धन कदम की जरूरत है ताकि तेजी से विभाजित कैंसर संबद्ध फाइब्रोब्लास्ट को खत्म करने के लिए कर रहे हैं. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम शल्य चिकित्सा से ट्यूमर को हटा दिया से संस्कृति SBNET कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है extracellular मैट्रिक्स (ECM) में spheroids के रूप में. ECM एक 3 आयामी मैट्रिक्स कि SBNET कोशिकाओं encapsulates और SBNET कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण mimics रूपों. यहाँ, हम SBNET spheroids की वृद्धि दर की विशेषता है और यह पुष्टि करने के लिए कि स्फीरोइड न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर कोशिकाओं रहे हैं प्रतिरक्षा प्रवाह माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग कर SBNET मार्करों की पहचान करने के लिए तरीकों का वर्णन किया। इसके अलावा, हम rapamycin के cytotoxicity के परीक्षण के लिए SBNET spheroids इस्तेमाल किया.
Introduction
छोटी आंत neuroendocrine ट्यूमर (SBNETs) छोटी आंत के आंत्ररोमाफिन कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं। हालांकि SBNETs आम तौर पर धीरे धीरे विकसित करने के लिए जाना जाता है, वे आमतौर पर जिगर1के लिए metastasize. जबकि शल्य चिकित्सा हटाने या ट्यूमर ablation कई मामलों में विचार किया जा सकता है, पुनरावृत्ति लगभग सार्वभौमिक है, और, इसलिए, चिकित्सा चिकित्सा प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. दवा परीक्षण के लिए नई एसबीनेट सेल लाइनें तैयार करने के लिए जबरदस्त प्रयास किए गए हैं। हालांकि, वहाँ बहुत कम सफलता मिली है. केवल 6 SBNET सेल लाइनों (KRJ-I, CND2, GOT1, पी-एसटीएस, एल-एसटीएस, एच-एसटीएस)2,3,4,5; और दुर्भाग्य से एक सेल लाइन अब नेट मार्करों6 और तीन अन्य SBNET सेल लाइनों (KRJ-I, एल-एसटीएस, एच-एसटीएस) व्यक्त करने के लिए NETs7के बजाय तब्दील लिम्फोब्लास्टसेंस से प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया गया था। SBNETs को लक्षित करने के लिए दवाओं की पहचान में तेजी लाने के लिए, इन विट्रो दवा परीक्षण के लिए वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता है।
यहाँ, हम resected SBNETs की उपलब्धता का लाभ लेने के लिए और संस्कृति के लिए एक रास्ता स्थापित किया है इन रोगी व्युत्पन्न SBNETs के रूप में Sheroids ECM में बढ़ रही है. इस पांडुलिपि के समग्र लक्ष्य के लिए एक तीन आयामी (3 डी) संस्कृति के रूप में संस्कृति SBNET के लिए एक विधि का वर्णन है और प्रक्रियाओं की रूपरेखा के लिए इम्यूनोफ्लोरेसीनॉबर स्केलिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा SBNET मार्करों के प्रतिधारण के लिए इन spheroids की विशेषता है.
इसके अलावा, हम प्रदर्शन कैसे इन SBNET spheroids rapamycin, NETs8के लिए एक विरोधी कैंसर दवा के प्रभाव के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के पीछे तर्क इन विट्रो में SBNET कोशिकाओं को विकसित करने और उन्हें दवा परीक्षण के लिए उपयोग करने के लिए एक नई विधि विकसित करने के लिए है। एक SBNET सेल लाइन की स्थापना की पारंपरिक विधि पर इस तकनीक का लाभ यह है कि SBNETs के 3 डी संस्कृतियों तेजी से प्राप्त किया जा सकता है और दवा परीक्षण 3 सप्ताह के भीतर किया जा सकता है. SBNET अफ़ीरॉइड ्सवेरा दवा स्क्रीन में प्रदर्शन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है SBNET रोगियों के लिए नई दवाओं की पहचान. चूंकि SBNET सेल लाइनों व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, SBNET अफ़ीरॉइड के 3 डी संस्कृतियों SBNETs के अध्ययन के लिए एक नए इन विट्रो मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं और क्षेत्र में वैज्ञानिकों के बीच साझा किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर 3 डी संस्कृतियों पूर्व नैदानिक दवा परीक्षण15के लिए एक मूल्यवान संसाधन बन गए हैं. हाल ही में स्तन कैंसर और प्रोस्टेट कैंसर ट्यूमर16,17से विभिन्न ट्यूमर organoid biobanks स्थापित…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान P50 CA174521 द्वारा समर्थित किया गया था (जे.आर. होवे और ए.एम. Bellizzi के लिए). पी.एच. कान P50 CA174521 कैरियर संवर्धन कार्यक्रम पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
