小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け
Summary
神経内分泌腫瘍(NETs)は神経堤の神経内分泌細胞に由来する。彼らは成長が遅く、文化に挑戦しています。我々は、スフェロイドとしてそれらを培養することにより、小腸からNETを成長させるための代替戦略を提示します。これらのスフェロイドは、小さな腸ネットマーカーを有し、薬物検査に使用することができます。
Abstract
小腸神経内分泌腫瘍(SBNET)は、腸の腸内クロマフィン細胞に由来する稀な癌である。この分野の研究は、非常に少数の患者由来SBNET細胞株が生成されているので、限られている。十分に分化したSBNET細胞は成長が遅く、伝播しにくい。確立された少数の細胞株は容易に利用できないし、培養中の時間が経つ後もNET細胞の特性を発現し続けないかもしれない。SBNET細胞は長い倍増時間を持ち、癌関連線維芽細胞を急速に分裂させるには多くの濃縮ステップが必要となるため、新しい細胞株の生成には何年もかかる可能性があります。これらの限界を克服するために、細胞外マトリックス(ECM)におけるスフェロイドとして外科的に除去された腫瘍からSBNET細胞を培養するプロトコルを開発しました。ECMは、SBNET細胞をカプセル化し、腫瘍微小環境を模倣してSBNET細胞の増殖を可能にする3次元マトリックスを形成する。ここでは、SBNETスフェロイドの増殖速度を特徴付け、免疫蛍光顕微鏡と免疫組織化学を用いてSBNETマーカーを同定する方法を説明し、スフェロイドが神経内分泌腫瘍細胞であることを確認した。また、ラパマイシンの細胞毒性を試験するためにSBNETスフェロイドを用いた。
Introduction
小腸神経内分泌腫瘍(SBNETs)は、小腸の腸内クロマフィン細胞に由来する。SBNETは一般的にゆっくりと成長することが知られているが、それらは一般的に肝臓1に転移する。外科的除去または腫瘍切除は多くの場合考えることができるが、再発はほぼ普遍的であり、したがって、医療療法は管理において重要な役割を果たす。薬物検査のための新しいSBNET細胞株を生成するために多大な努力が投資されています。しかし、成功はほとんどありませんでした。6つのSBNET細胞株(KRJ-I、CND2、GOT1、P-STS、L-STS、H-STS)のみが報告されています2,3,4,5;そして残念ながら、1つの細胞株はもはやNETマーカー6および他の3つのSBNET細胞株(KRJ-I、L-STS、H-STS)を発現しなくなり、NETs7の代わりに形質転換リンパ芽球に由来すると判断した。SBnETを標的とする薬剤の同定を加速するためには、インビトロ薬物検査のための代替方法が必要である。
ここでは、切除されたSBNETの利用可能性を利用し、ECMで成長するスフェロイドとしてこれらの患者由来SBNETを培養する方法を確立した。この原稿の全体的な目標は、免疫蛍光染色および免疫組織化学によるSBNETマーカーの保持のためのこれらのスフェロイドを特徴付ける3次元(3D)培養および輪郭手順としてSBNETを培養する方法を記述することです。
さらに、これらのSBNETスフェロイドをNETs8の抗癌剤であるラパマイシンの効果をテストするためにどのように使用できるかを示す。このプロトコルの背後にある根拠は、インビトロでSBNET細胞を成長させ、薬物検査に使用する新しい方法を開発することです。SBNET細胞株を確立する従来の方法に対するこの技術の利点は、SBnNETの3D培養物を迅速に得ることができ、薬物検査を3週間以内に行うことです。SBNETのスフェロイドは、SBNET患者の新薬を同定するためにインビトロ薬剤スクリーンを行うためのモデルとして使用される可能性がある。SBNET細胞株は広く利用できないため、SBNETスフェロイドの3D培養はSBNNETを研究するための新しいインビトロモデルとして機能し、現場の科学者間で共有することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍3D培養は、前臨床薬物検査15のための貴重なリソースとなっている。乳癌および前立腺癌腫瘍16,17から様々な腫瘍オルガノイドバイオバンクが最近確立されている。本研究では、SBNETをスフェロイドとして培養するための詳細なプロトコルと、免疫蛍光と試験薬物感受性によってNETマーカーのスフェロイド培養を検証する簡単か…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金P50 CA174521(J.R.ハウとA.M.ベリッツィに)によってサポートされました。P.H. Earは、P50 CA174521キャリア向上プログラム賞を受賞しています。
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
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