작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화
Summary
신경 내분비 종양 (NETs) 신경 문장의 신경 내분비 세포에서 유래. 그들은 천천히 성장하고 문화에 도전. 우리는 스페로이드로 그들을 배양하여 작은 창자에서 NET를 성장하는 대체 전략을 제시한다. 이 스페로이드는 작은 창자 그물 마커가 있고 약 시험을 위해 이용될 수 있습니다.
Abstract
작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNETs)는 창자의 enterochromaffin 세포에서 유래하는 희소한 암입니다. 이 분야의 연구는 SBNET 세포주에서 유래된 환자가 거의 없기 때문에 제한적이었다. 잘 분화된 SBNET 셀은 천천히 성장하고 전파하기 어렵습니다. 확립된 몇몇 세포주는 쉽게 유효하지 않으며, 배양에 있는 시간 후에 NET 세포의 특성을 발현하는 것을 계속하지 않을 수 있습니다. SBNET 세포는 긴 두 배의 시간을 가지고 있기 때문에 새로운 세포주를 생성하는 것은 많은 년이 걸릴 수 있고 급속하게 분할하는 암 관련 섬유아세포를 제거하기 위하여 많은 농축 단계가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 스페로이드로 외과적으로 제거 된 종양으로부터 SBNET 세포를 배양하는 프로토콜을 개발했습니다. ECM은 SBNET 세포를 캡슐화하고 SBNET 세포가 성장할 수 있도록 종양 미세 환경을 모방하는 3차원 매트릭스를 형성합니다. 여기서, 우리는 SBNET 스페로이드의 성장 속도를 특징으로 하고, spheroids가 신경 내분비 종양 세포임을 확인하기 위해 면역형광 현미경 및 면역조직화학을 사용하여 SBNET 마커를 식별하는 방법을 기술하였다. 또한, 우리는 라파마이신의 세포 독성을 테스트하기 위해 SBNET 스페로이드를 사용했습니다.
Introduction
작은 창자 신경 내분비 종양 (SBNETs)는 소장의 엔테로크로마틴 세포에서 유래합니다. SBNETs는 일반적으로 천천히 성장하는 것으로 알려져 있지만, 그들은 일반적으로 간1에전이. 외과 제거 또는 종양 절제는 많은 경우에 고려될 수 있는 동안, 재발은 거의 보편적이고, 그러므로, 의학 치료는 관리에 있는 중요한 역할을 합니다. 약물 검사를 위한 새로운 SBNET 세포주를 생성하기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다. 그러나, 거의 성공이 있었다. 만 6 SBNET 세포주 (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5보고되었습니다; 불행하게도 하나의 세포주들은 더 이상 NET 마커6및 3개의 다른 SBNET 세포주(KRJ-I, L-STS, H-STS)를 발현하지 않고 NETs7대신형 림프체로부터 유래되는 것으로 결정되었다. SBNET를 표적으로 하는 약물의 식별을 가속화하기 위해서는 시험관 내 약물 검사를 위한 대체 방법이 필요합니다.
여기에서, 우리는 절제된 SBNETs의 가용성을 이용하고 ECM에서 성장하는 스페로이드로 이 환자 파생 SBNETs를 배양하는 쪽을 설치했습니다. 이 원고의 전반적인 목표는 면역형광 염색 및 면역조직화학에 의한 SBNET 마커의 보존을 위해 이러한 스페로이드를 특성화하는 3차원(3D) 배양 및 개요 절차로서 SBNET 배양 방법을 설명하는 것이다.
또한, 우리는 이러한 SBNET 스페로이드가 NETS8의항암 약물인 라파마이신의 효과를 테스트하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이 프로토콜의 근거는 시험관에서 SBNET 세포를 성장하고 약물 검사에 사용하는 새로운 방법을 개발하는 것입니다. SBNET 세포주를 확립하는 전통적인 방법에 비해 이 기술의 장점은 SBNE의 3D 배양이 빠르게 얻을 수 있고 약물 검사가 3 주 이내에 수행 될 수 있다는 것입니다. SBNET 스페로이드는 잠재적으로 SBNET 환자를 위한 새로운 약을 확인하기 위하여 시험관 내 약 스크린을 능력을 발휘하기 위한 모형으로 이용될 수 있었습니다. SBNET 세포주들은 널리 사용할 수 없기 때문에, SBNET 스페로이드의 3D 배양은 SBNE를 연구하기 위한 새로운 시험관 내 모델로 사용될 수 있으며, 현장의 과학자들 사이에서 공유될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 3D 배양은 전임상 약물 시험15에대한 귀중한 자원이 되었다. 다양한 종양 오르가노이드 바이오뱅크는 최근 유방암 및 전립선암 종양16,17에서설립되었다. 본 연구에서, 우리는 SBNET배양에 대한 상세한 프로토콜을 스페로이드로 하고 면역형광 및 시험 약물 감도에 의해 NET 마커에 대한 스페로이드 배양을 검증하는 간단하고 빠른 방?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 P50 CA174521에 의해 지원되었다 (J.R. 하우와 A.M. 벨리치에). P.H. Ear는 P50 CA174521 커리어 향상 프로그램 상을 수상했습니다.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
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