Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids
Summary
Nevroendokrine svulster (NETs) stammer fra Nevroendokrine celler av Neural Crest. De er langsom voksing og utfordrende å kulturen. Vi presenterer en alternativ strategi for å vokse garn fra tynntarmen ved å dyrking dem som spheroids. Disse spheroids har liten tarmen NET markører og kan brukes til narkotika testing.
Abstract
Små tarm Nevroendokrine svulster (SBNETs) er sjeldne kreftformer stammer fra enterochromaffin celler i tarmen. Forskning på dette feltet har vært begrenset fordi svært få pasienter avledet SBNET cellelinjer har blitt generert. Godt differensiert SBNET celler er langsom vekst og er vanskelig å spre. De få cellelinjer som er etablert er ikke lett tilgjengelig, og etter gang i kulturen kan ikke fortsette å uttrykke egenskapene til NET celler. Generere nye cellelinjer kan ta mange år siden SBNET celler har en lang dobling tid og mange berikelse skritt er nødvendig for å eliminere raskt dele kreft-assosiert fibroblaster. For å overvinne disse begrensningene, har vi utviklet en protokoll til kultur SBNET celler fra kirurgisk fjernet svulster som spheroids i ekstracellulære matrise (ECM). ECM danner en 3-dimensjonal matrise som omslutter SBNET celler og etterligner tumor mikro-miljøet for å la SBNET celler til å vokse. Her har vi karakterisert vekstraten til SBNET spheroids og beskrev metoder for å identifisere SBNET markører ved hjelp av immunofluorescence mikroskopi og immunhistokjemi for å bekrefte at spheroids er Nevroendokrine tumorceller. I tillegg har vi brukt SBNET spheroids for testing av cytotoksisitet av Rapamycin.
Introduction
Små tarm Nevroendokrine svulster (SBNETs) stammer fra enterochromaffin celler i tynntarmen. Selv SBNETs er generelt kjent for å vokse langsomt, de vanligvis metastase til leveren1. Mens kirurgisk fjerning eller tumor ablasjon kan vurderes i mange tilfeller, gjentakelse er nesten universell, og derfor medisinsk terapi spiller en viktig rolle i ledelsen. Enorm innsats har blitt investert for å generere nye SBNET cellelinjer for narkotika testing. Men det har vært svært liten suksess. Bare 6 SBNET cellelinjer (krj-I, CND2, GOT1, vrang-STS, L-m, H-STS) har blitt rapportert2,3,4,5; og dessverre en cellelinje ikke lenger uttrykker NET markører6 og tre andre SBNET celle Lines (krj-I, L-STS, H-STS) var fast bestemt på å være avledet fra transformert lymphoblasts i stedet for Nets7. For å akselerere identifisering av legemidler for målretting SBNETs, alternative metoder for in vitro narkotika testing er nødvendig.
Her tar vi nytte av tilgjengeligheten av resected SBNETs og har etablert en måte å kultur disse pasient-avledet SBNETs som spheroids vokser i ECM. Det overordnede målet med dette manuskriptet er å beskrive en metode til kultur SBNET som en tredimensjonal (3D) kultur og skissere prosedyrer for å karakterisere disse spheroids for oppbevaring av SBNET markører ved immunofluorescence farging og immunhistokjemi.
I tillegg viser vi hvordan disse SBNET spheroids kan brukes til å teste effekten av Rapamycin, et anti-kreft stoff for NETs8. Begrunnelsen bak denne protokollen er å utvikle en ny metode for å vokse SBNET celler in vitro og bruke dem for narkotika testing. Fordelen med denne teknikken over den tradisjonelle metoden for å etablere en SBNET cellelinje er at 3D-kulturer av SBNETs kan raskt bli innhentet og narkotika testing kan gjøres innen 3 uker. SBNET-spheroids kan potensielt brukes som en modell for utføring av stoff skjermer i vitro for å identifisere nye legemidler for SBNET-pasienter. Siden SBNET cellelinjer ikke er allment tilgjengelige, kan 3D-kulturer av SBNET-spheroids tjene som en ny in vitro-modell for å studere SBNETs og kan deles blant forskere i felten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor 3D kulturer har blitt en verdifull ressurs for prekliniske narkotika testing15. Ulike tumor organoid biobanker har nylig blitt etablert fra brystkreft og prostata kreftsvulster16,17. I denne studien, gir vi en detaljert protokoll til kultur SBNET som spheroids og en enkel og rask metode for å validere spheroid kulturer for NET markører ved immunofluorescence og teste narkotika følsomhet. Fra vår erfaring, SBNET spheroids kan voks…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P50 CA174521 (til Jr Howe og A.M. Bellizzi). P.H. Ear er en mottaker av P50 CA174521 karriere Enhancement program prisen.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
