Создание и характеристика малого кишечника нейроэндокринных опухолевых сфероидов
Summary
Нейроэндокринные опухоли (NET) происходят из нейроэндокринных клеток нервного гребня. Они медленно растут и бросают вызов культуре. Мы представляем альтернативную стратегию для выращивания NETs из тонкой кишки, культивируя их как сфероиды. Эти сфероиды имеют маркеры NET тонкой кишки и могут быть использованы для тестирования на наркотики.
Abstract
Опухоли тонкой кишки (SBNETs) являются редкими раковыми заболеваниями, происходящими из энтерохромаффиновых клеток кишечника. Исследования в этой области были ограничены, потому что очень мало пациентов, полученных SBNET клеточных линий были созданы. Хорошо дифференцированные клетки SBNET медленно растут и их трудно размножаться. Несколько установленных клеточных линий не всегда доступны, и через некоторое время в культуре может не продолжать выражать характеристики клеток NET. Создание новых клеточных линий может занять много лет, так как клетки SBNET имеют долгое время удвоения и многие шаги по обогащению необходимы для того, чтобы устранить быстрое разделение связанных с раком фибробластов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали протокол к культуре SBNET клеток из хирургически удаленных опухолей, как сфероиды во внеклеточной матрицы (ECM). ECM образует трехмерную матрицу, которая инкапсулирует клетки SBNET и имитирует микро-среду опухоли, позволяя клеткам SBNET расти. Здесь мы охарактеризовали темпы роста сфероидов SBNET и описали методы выявления маркеров SBNET с помощью иммунофлюоресценциальной микроскопии и иммуногистохимии, чтобы подтвердить, что сфероиды являются нейроэндокринными опухолевыми клетками. Кроме того, мы использовали сфероиды SBNET для тестирования цитотоксичности рапамицина.
Introduction
Опухоли тонкой кишки нейроэндокринных (SBNETs) происходят из энтерохромаффина клеток тонкой кишки. Хотя SBNETs, как известно, растут медленно, они обычно метастазируют в печень1. Хотя хирургическое удаление или абляция опухоли может быть рассмотренво во многих случаях, рецидив почти универсальный, и, следовательно, медицинская терапия играет важную роль в управлении. Огромные усилия были вложены для создания новых линий клеток SBNET для тестирования на наркотики. Однако успеха получило очень мало. Только 6 сотовых линий SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) были зарегистрированы2,3,4,5; и, к сожалению, одна клеточная линия больше не выражает NET маркеры6 и три других SBNET клеточных линий (KRJ-I, L-STS, H-STS) были определены, чтобы быть производным от преобразованных лимфобластов вместо NETs7. Для ускорения выявления лекарств для таргетирования СБНЕТ необходимы альтернативные методы тестирования на наркотики in vitro.
Здесь мы пользуемся наличием резецированных SBNETs и создали способ культуры этих пациентов полученных SBNETs как сфероиды, растущие в ECM. Общая цель этой рукописи заключается в описании метода культуры SBNET как трехмерной (3D) культуры и наброски процедур для характеристики этих сфероидов для удержания маркеров SBNET путем обертывания иммунофлюоресценции и иммуногистохимии.
Кроме того, мы демонстрируем, как эти сфероиды SBNET могут быть использованы для тестирования эффекта рапамицина, противоракового препарата для NETs8. Обоснованием этого протокола является разработка нового метода для выращивания клеток SBNET in vitro и их использования для тестирования на наркотики. Преимущество этого метода по сравнению с традиционным методом создания клеточной линии SBNET заключается в том, что 3D культуры SBNETs могут быть быстро получены и тестирование на наркотики может быть сделано в течение 3 недель. Сфероиды SBNET потенциально могут быть использованы в качестве модели для выполнения экранов в пробирке наркотиков для выявления новых препаратов для пациентов SBNET. Поскольку линии клеток SBNET не являются широко доступными, 3D культуры сфероидов SBNET могут служить новой моделью in vitro для изучения SBNETs и могут быть распространены среди ученых в этой области.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опухолевые 3D культуры стали ценным ресурсом для доклинического тестирования нанаркотики 15. Различные опухолевые органоидные биобанки недавно были созданы из рака молочной железы и опухолей рака предстательной железы16,17. В этом исследован?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грантов P50 CA174521 (J.R. Хоу и А. М. Bellizzi). P.H. Ear является получателем премии P50 CA174521 по улучшению карьеры.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
