Etablering och karakterisering av små tarm neuroendokrina tumör spheroids
Summary
Neuroendokrina tumörer (NETs) härstammar från neuroendokrina celler i neurala Crest. De är långsamt växande och utmanande för kulturen. Vi presenterar en alternativ strategi för att odla nät från tunntarm genom odling av dem som spheroids. Dessa spheroids har små tarm nät markörer och kan användas för drogtester.
Abstract
Små tarm neuroendokrina tumörer (SBNETs) är sällsynta cancerformer som härrör från enterochromaffin celler i tarmen. Forskning inom detta område har begränsats eftersom mycket få patient härledda SBNET cellinjer har genererats. Väl differentierade SBNET celler är långsamt växande och är svåra att propagera. De få cell linjer som har upprättats är inte lätt tillgängliga, och efter tid i kulturen får inte fortsätta att uttrycka egenskaper hos netto celler. Generera nya cellinjer kan ta många år sedan SBNET celler har en lång fördubbling tid och många berikande steg behövs för att eliminera den snabbt dividera cancer-associerade fibroblaster. För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat ett protokoll till kultur SBNET celler från kirurgiskt borttagna tumörer som spheroids i extracellulära matrix (ECM). ECM bildar en 3-dimensionell matris som kapslar SBNET celler och härmar tumören mikro-miljö för att tillåta SBNET celler att växa. Här har vi karakteriserat tillväxttakten för SBNET spheroids och beskrivna metoder för att identifiera SBNET markörer med hjälp av immunofluorescensmikroskopi och immunohistokemi för att bekräfta att spheroids är neuroendokrina tumörceller. Dessutom använde vi SBNET spheroids för att testa cytotoxicitet av rapamycin.
Introduction
Små tarm neuroendokrina tumörer (SBNETs) härstammar från enterochromaffin celler i tunntarmen. Även om sbnets är allmänt kända för att växa långsamt, de ofta metastasera till levern1. Medan kirurgiskt avlägsnande eller tumör ablation kan övervägas i många fall, upprepning är nästan universell, och, därför, medicinsk behandling spelar en viktig roll i förvaltningen. Enorma ansträngningar har investerats för att generera nya SBNET cellinjer för drogtester. Men det har varit mycket liten framgång. Endast 6 sbnet cellinjer (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) har rapporterats2,3,4,5; och tyvärr en cell linje inte längre uttrycker netto markörer6 och tre andra sbnet cellinjer (KRJ-I, L-STS, H-STS) bestämdes att härledas från transformerade lymfoblaster i stället för nät7. För att påskynda identifieringen av läkemedel för att inrikta sig på SBNETs, behövs alternativa metoder för in vitro-drogtester.
Här drar vi nytta av tillgängligheten av resected SBNETs och har etablerat ett sätt att odla dessa patient-härledda SBNETs som spheroids växer i ECM. Det övergripande målet med detta manuskript är att beskriva en metod för att odla SBNET som en tredimensionell (3D) kultur och skissera förfaranden för att karakterisera dessa spheroids för bibehållande av SBNET markörer genom immunofluorescensfärgning och immunohistokemi.
Dessutom visar vi hur dessa SBNET spheroids kan användas för att testa effekten av rapamycin, en anti-cancerläkemedel för NETs8. Logiken bakom detta protokoll är att utveckla en ny metod för att odla SBNET-celler in vitro och använda dem för drogtester. Fördelen med denna teknik över den traditionella metoden för att etablera en SBNET cellinjer är att 3D-kulturer av SBNETs snabbt kan erhållas och drogtester kan göras inom 3 veckor. SBNET spheroids kan potentiellt användas som en modell för att utföra in vitro-läkemedel skärmar för att identifiera nya läkemedel för SBNET patienter. Eftersom SBNET cellinjer inte är allmänt tillgängliga, 3D-kulturer av SBNET spheroids kan fungera som en ny in vitro-modell för att studera SBNETs och kan delas mellan forskare inom området.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumör 3D-kulturer har blivit en värdefull resurs för prekliniska drogtester15. Olika tumör Organoid biobanker har nyligen etablerats från bröstcancer och prostatacancertumörer16,17. I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll till kultur SBNET som spheroids och en enkel och snabb metod för att validera sfäroid kulturer för netto markörer genom immunofluorescensbildning och test läkemedels känslighet. Från vår erfarenhet k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH Grants P50 CA174521 (till Jr Howe och A.M. Bellizzi). P.H. ear är mottagare av P50 CA174521 karriär Enhancement program Award.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
Referências
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
