Beskrevet her er tre eksperimentelle tilnærminger for å studere dynamikken i HIV-smitte i humanisert mus. Den første tillater studiet av kroniske infeksjons hendelser, mens de to sistnevnte gjør det mulig for studiet av akutte hendelser etter primær infeksjon eller viral reaktivering.
Humanisert NOD/SCID/IL-2 reseptor γ-null mus recapitulate noen funksjoner av menneskelig immunitet, som kan utnyttes i grunnleggende og pre-klinisk forskning på smittsomme sykdommer. Beskrevet her er tre modeller av humanisert immunodeficient mus for å studere dynamikken i HIV-smitte. Den første er basert på intrahepatic injeksjon av CD34+ blodkreft stamceller hos nyfødte mus, som gjør det mulig for rekonstituering av flere blod og lymfoide vev-trange celler, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning. Denne modellen gjør det mulig å overvåke i opptil 36 uker etter infeksjon, og derfor kalles den kroniske modellen. Den andre og tredje modellene er referert til som akutt og reaktivering modeller, der perifere blod mononukleære celler er intraperitonealt injisert i voksen mus. I den akutte modellen, celler fra en sunn donor er engrafted gjennom intraperitoneal ruten, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning. Til slutt, i reaktivering modellen, celler fra en HIV-smittet donor under antiretroviral terapi er engrafted via intraperitoneal ruten. I dette tilfellet gir et stoff-fritt miljø i musen for virus reaktivering og en økning i viral belastning. Protokollene gitt her beskriver den konvensjonelle eksperimentelle tilnærmingen for humanisert, immunodeficient mus modeller av HIV-smitte.
Den humanisert NOD/SCID/interleukin (IL)-2 reseptor γ-kjedennull (heretter referert til som hunerne γ-Chainnull) mus modellen har vært mye brukt for å studere patogenesen av infeksjoner, autoimmunitet og kreft, samt for pre-kliniske studier av narkotika og menneskelig celle-baserte terapier1,2. Disse musene er basert på en ikke-obese diabetiker (NOD) bakgrunn, med scid mutasjon og målrettet MUTASJON på Il-2 reseptor γ-kjeden geometriske (felles γ-KJEDEN for Il-2, Il-4, Il-7, Il-9, Il-15, og Il-21), som induserer en alvorlig svekkelse i utviklingen av musen T-, B-, og naturlig Killer (NK) celler1. Dermed støtter de engraftment av menneskelig vev, humant CD34+ blodkreft stamceller (HSCs), og humant perifert blod mononukleære celler (pbmc)3,4,5. I tillegg, transgene uttrykk for menneskelig blodkreft faktorer, slik som stilk cellen faktoren (scf), granulocytt/macrophage koloni-stimulerende Factor (GM-CSF), og Il-3 fremmer engraftment av menneskelig myelogen bestander6,7,8.
For HIV-studier har flere hunerne γ-modeller mednull mus blitt beskrevet, noe som er forskjellig i belastningen på musen, type menneskelige celler som brukes, type vev for engraftment, og opprinnelsen til celler (dvs. sunn vs. HIV-smittet donor)9,10. Den opprinnelige belastningen, derimot, er mye brukt på grunn av de høye nivåene av menneskelige celler engraftment og viral replikering etter infeksjon med en referanse HIV-belastning11,12,13. Lignende immunodeficient mus stammer med transgene uttrykk for menneskelig blodkreft faktorer (f. eks, NOG-EXL eller NSG-SGM3) eller med implantater av menneskelig lever og thymus vev (benmarg-Liver-thymus [BLT] mus) er nyttige for å evaluere rollen til myelogen populasjoner i anti-HIV immunrespons, effekter av HIV på disse vev, og deres deltakelse som viral reservoarer14,15. Videre kan noen stammer med transgene uttrykk for humant leukocytter antigen (HLA) molekyler, samt BLT mus, brukes til å studere T-Cell respons på HIV-smitte16,17.
Generelt, i disse musene, menneskeliggjøring avhengig av mobilnettet opprinnelse, levering rute (intraperitoneal, intrahepatic, intravenøs, intrakardielle) og mus alder på tidspunktet for engraftment18,19,20. Når det gjelder cellen opprinnelse, Human CD34+ HSC avledet fra ledningen blod, fosterets lever, eller mobilisert perifert blod kan injiseres i nyfødte eller unge mus3,21. I tillegg voksne γ-kjedennull mus kan bli humanisert ved injeksjon av PBMC (her referert til som Hu-PBL-NS γ-kjedennull mus), slik at Temporal sirkulasjon av disse cellene i blodet, sekundære lymfoide organer, og betent vev22,23,24.
Beskrevet her er en detaljert protokoll for etablering av hunerne γ-kjedennull mus modeller for STUDIET av HIV-smitte. Den første er den kroniske modellen, der menneskelige CD34+ HSCs avledet fra ledningen blod fra en sunn donor injiseres i nyfødte mus, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning etter 14 uker av menneskelig immunsystem rekonstituering. Denne modellen gjør det mulig å overvåke mus i opptil ~ 36 uker etter smitte. Den andre modellen er en akutt modell, der Pbmc avledet fra en sunn donor injiseres i voksen NS γ-kjedennull mus, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning etter 3 uker av menneskelig T-celle ekspansjon i musen. Til slutt, den tredje modellen er reaktivering modellen, der Pbmc avledet fra en HIV-smittet donor under undertrykkende antiretroviral behandling (ART) injiseres i voksen NS γ-kjedennull mus. I dette tilfellet, et medikament fritt miljø tillater viral reaktivering og økning i viral belastning. De to sistnevnte modellene tillate overvåking i opptil ~ 9 uker etter engraftment.
Overall, disse tre modellene er nyttige for virological studier, pre-kliniske studier av romanen narkotika, og evaluering av HIV-smitteeffekter på global immunrespons. Det er også viktig å vurdere at bruk av HIV-infiserte humanisert mus krever gjennomgang og godkjenning av institusjonelle biosafety Committee (IBC) så vel som av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) før noen eksperiment. Dette sikrer at studien følger alle interne og eksterne institusjonelle forskrifter for bruk av farlig biologisk materiale og Human håndtering av forsøksdyr.
Viktige fremskritt har blitt oppnådd i utviklingen av immunodeficient mus stammer for menneskeliggjøring, med en rekke ulike alternativer som kan brukes i henhold til forskningen interesse1. Forutsatt her er en generell protokoll for menneskeliggjøring av NS γ-null mus og genetisk lignende stammer som skal benyttes i tre forskjellige modeller for å studere HIV-smitte. I den første eksperimentelle tilnærmingen, bestrålt nyfødte mus injiseres med humant CD34+ HSCs, som…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av IHV kliniske divisjon interne midler til JCZ.
0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
Clear jar | Amazon | 77977 | |
Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
FACS lysing solution | BD | 340202 | |
FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
Micro pipettes | |||
Microcentrifuge | Eppendorf | ||
Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |