Kronisk, akutt, og reaktivert HIV infeksjon i Humanisert Immunodeficient Mouse modeller
Summary
Beskrevet her er tre eksperimentelle tilnærminger for å studere dynamikken i HIV-smitte i humanisert mus. Den første tillater studiet av kroniske infeksjons hendelser, mens de to sistnevnte gjør det mulig for studiet av akutte hendelser etter primær infeksjon eller viral reaktivering.
Abstract
Humanisert NOD/SCID/IL-2 reseptor γ-null mus recapitulate noen funksjoner av menneskelig immunitet, som kan utnyttes i grunnleggende og pre-klinisk forskning på smittsomme sykdommer. Beskrevet her er tre modeller av humanisert immunodeficient mus for å studere dynamikken i HIV-smitte. Den første er basert på intrahepatic injeksjon av CD34+ blodkreft stamceller hos nyfødte mus, som gjør det mulig for rekonstituering av flere blod og lymfoide vev-trange celler, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning. Denne modellen gjør det mulig å overvåke i opptil 36 uker etter infeksjon, og derfor kalles den kroniske modellen. Den andre og tredje modellene er referert til som akutt og reaktivering modeller, der perifere blod mononukleære celler er intraperitonealt injisert i voksen mus. I den akutte modellen, celler fra en sunn donor er engrafted gjennom intraperitoneal ruten, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning. Til slutt, i reaktivering modellen, celler fra en HIV-smittet donor under antiretroviral terapi er engrafted via intraperitoneal ruten. I dette tilfellet gir et stoff-fritt miljø i musen for virus reaktivering og en økning i viral belastning. Protokollene gitt her beskriver den konvensjonelle eksperimentelle tilnærmingen for humanisert, immunodeficient mus modeller av HIV-smitte.
Introduction
Den humanisert NOD/SCID/interleukin (IL)-2 reseptor γ-kjedennull (heretter referert til som hunerne γ-Chainnull) mus modellen har vært mye brukt for å studere patogenesen av infeksjoner, autoimmunitet og kreft, samt for pre-kliniske studier av narkotika og menneskelig celle-baserte terapier1,2. Disse musene er basert på en ikke-obese diabetiker (NOD) bakgrunn, med scid mutasjon og målrettet MUTASJON på Il-2 reseptor γ-kjeden geometriske (felles γ-KJEDEN for Il-2, Il-4, Il-7, Il-9, Il-15, og Il-21), som induserer en alvorlig svekkelse i utviklingen av musen T-, B-, og naturlig Killer (NK) celler1. Dermed støtter de engraftment av menneskelig vev, humant CD34+ blodkreft stamceller (HSCs), og humant perifert blod mononukleære celler (pbmc)3,4,5. I tillegg, transgene uttrykk for menneskelig blodkreft faktorer, slik som stilk cellen faktoren (scf), granulocytt/macrophage koloni-stimulerende Factor (GM-CSF), og Il-3 fremmer engraftment av menneskelig myelogen bestander6,7,8.
For HIV-studier har flere hunerne γ-modeller mednull mus blitt beskrevet, noe som er forskjellig i belastningen på musen, type menneskelige celler som brukes, type vev for engraftment, og opprinnelsen til celler (dvs. sunn vs. HIV-smittet donor)9,10. Den opprinnelige belastningen, derimot, er mye brukt på grunn av de høye nivåene av menneskelige celler engraftment og viral replikering etter infeksjon med en referanse HIV-belastning11,12,13. Lignende immunodeficient mus stammer med transgene uttrykk for menneskelig blodkreft faktorer (f. eks, NOG-EXL eller NSG-SGM3) eller med implantater av menneskelig lever og thymus vev (benmarg-Liver-thymus [BLT] mus) er nyttige for å evaluere rollen til myelogen populasjoner i anti-HIV immunrespons, effekter av HIV på disse vev, og deres deltakelse som viral reservoarer14,15. Videre kan noen stammer med transgene uttrykk for humant leukocytter antigen (HLA) molekyler, samt BLT mus, brukes til å studere T-Cell respons på HIV-smitte16,17.
Generelt, i disse musene, menneskeliggjøring avhengig av mobilnettet opprinnelse, levering rute (intraperitoneal, intrahepatic, intravenøs, intrakardielle) og mus alder på tidspunktet for engraftment18,19,20. Når det gjelder cellen opprinnelse, Human CD34+ HSC avledet fra ledningen blod, fosterets lever, eller mobilisert perifert blod kan injiseres i nyfødte eller unge mus3,21. I tillegg voksne γ-kjedennull mus kan bli humanisert ved injeksjon av PBMC (her referert til som Hu-PBL-NS γ-kjedennull mus), slik at Temporal sirkulasjon av disse cellene i blodet, sekundære lymfoide organer, og betent vev22,23,24.
Beskrevet her er en detaljert protokoll for etablering av hunerne γ-kjedennull mus modeller for STUDIET av HIV-smitte. Den første er den kroniske modellen, der menneskelige CD34+ HSCs avledet fra ledningen blod fra en sunn donor injiseres i nyfødte mus, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning etter 14 uker av menneskelig immunsystem rekonstituering. Denne modellen gjør det mulig å overvåke mus i opptil ~ 36 uker etter smitte. Den andre modellen er en akutt modell, der Pbmc avledet fra en sunn donor injiseres i voksen NS γ-kjedennull mus, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning etter 3 uker av menneskelig T-celle ekspansjon i musen. Til slutt, den tredje modellen er reaktivering modellen, der Pbmc avledet fra en HIV-smittet donor under undertrykkende antiretroviral behandling (ART) injiseres i voksen NS γ-kjedennull mus. I dette tilfellet, et medikament fritt miljø tillater viral reaktivering og økning i viral belastning. De to sistnevnte modellene tillate overvåking i opptil ~ 9 uker etter engraftment.
Overall, disse tre modellene er nyttige for virological studier, pre-kliniske studier av romanen narkotika, og evaluering av HIV-smitteeffekter på global immunrespons. Det er også viktig å vurdere at bruk av HIV-infiserte humanisert mus krever gjennomgang og godkjenning av institusjonelle biosafety Committee (IBC) så vel som av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) før noen eksperiment. Dette sikrer at studien følger alle interne og eksterne institusjonelle forskrifter for bruk av farlig biologisk materiale og Human håndtering av forsøksdyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktige fremskritt har blitt oppnådd i utviklingen av immunodeficient mus stammer for menneskeliggjøring, med en rekke ulike alternativer som kan brukes i henhold til forskningen interesse1. Forutsatt her er en generell protokoll for menneskeliggjøring av NS γ-null mus og genetisk lignende stammer som skal benyttes i tre forskjellige modeller for å studere HIV-smitte. I den første eksperimentelle tilnærmingen, bestrålt nyfødte mus injiseres med humant CD34+ HSCs, som…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av IHV kliniske divisjon interne midler til JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
Referências
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
