En lagdelt montering metode for utvidet tidsforløp Konfokalmikroskopi mikroskopi av hele sebrafisk embryo
Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å montere skjøre sebrafisk embryo for utvidet tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne rimelige metoden er enkel å utføre ved hjelp av vanlige glass-bunn mikroskopi retter for bildebehandling på noen invertert mikroskop. Monteringen utføres i lag av agarose i ulike konsentrasjoner.
Abstract
Dynamikken i utviklingen kan etterfølges av konfokalmikroskopi time-lapse mikroskopi av levende transgene sebrafisk embryo uttrykker fluorescens i bestemte vev eller celler. Et problem med Imaging hele embryoutvikling er at sebrafisk embryo vokse betydelig i lengde. Når montert som regelmessig gjort i 0,3-1% lav smelte agarose, pålegger agarose vekst restriksjon, som fører til skjevheter i den myke embryo kroppen. Likevel, for å utføre konfokalmikroskopi time-lapse mikroskopi, må fosteret være immobilisert. Denne artikkelen beskriver en lagdelt montering metode for sebrafisk embryo som begrenser motilitet av embryo samtidig gir for Ubegrenset vekst. Monteringen utføres i lag av agarose i ulike konsentrasjoner. For å demonstrere brukbarheten av denne metoden, ble hele embryo vaskulær, neuronal og muskelutvikling avbildet i transgene fisk for 55 sammenhengende timer. Denne monteringsmetoden kan brukes for enkel, rimelig Imaging av hele sebrafisk embryo bruker invertert mikroskop uten krav til mugg eller spesialutstyr.
Introduction
Sebrafisk har lenge vært en modell organisme for utviklingsmessige biologi, og mikroskopi er den viktigste metoden for å visualisere embryoutvikling. Fordelene ved å bruke sebrafisk embryo for utviklingsstudier inkluderer liten størrelse, optisk klarhet, rask utvikling, og høy fekunditet av den voksne fisken. Generering av transgene sebrafisk linjer som uttrykker fluorescens i visse vev eller celler har tillatt for en direkte visualisering av vev utvikling på måter som ikke er mulig med større virveldyr dyr. I kombinasjon med tidsforløp mikroskopi, detaljer og dynamikk av vev utvikling kan lett studert.
Et problem med Imaging sebrafisk utvikling er at embryo vokser betydelig i lengde; embryo utvider sin lengde fire ganger i løpet av de første 3 dagene av livet1. Dessuten er kroppen av de tidlige embryo myk, og lett blir forvrengt hvis veksten er begrenset. Likevel, for å utføre konfokalmikroskopi mikroskopi, må fosteret være immobilisert. For å holde embryo i en fast posisjon for konfokalmikroskopi time-lapse Imaging, de er regelmessig anesthetized og montert i 0,3-1% lav-smelte agarose. Dette har fordelen av å la for noen vekst under Imaging for en viss tid, mens begrense bevegelsene til fosteret. Deler av fosteret kan effektivt bli avbildet som dette. Men når du bruker denne metoden for Imaging av hele embryo for lengre tidsperioder, er skjevheter observert på grunn av begrenset vekst forårsaket av agarose. Dermed er andre monteringsmetoder nødvendig. Kaufmann og kolleger har beskrevet en alternativ montering av sebrafisk embryo for lys ark mikroskopi, for eksempel selektiv fly belysning mikroskopi (SPIM), ved å montere embryo i fluoriserte etylen propylenglykol (FEP) rør som inneholder lave konsentrasjoner av agarose eller methylcellulose2. Denne teknikken gir en suveren visualisering av embryogenesis over tid. Schmid et al. beskriver montering av opptil seks embryo i agarose i FEBRUAR-rør for mikroskopi3 som gir visualisering av flere embryo i en bilde økt. Muggsopp har blitt brukt til å lage embryo arrays for effektiv montering av større antall embryo4. Masselkink et al. har bygget 3D trykt plast muggsopp som kan brukes til å lage silisium kaster som sebrafisk embryo på ulike stadier kan plasseres i, slik at montering i en konstant posisjon for Imaging, inkludert konfokalmikroskopi Imaging5. 3D-utskrift har også blitt brukt til å lage former for konsistent posisjonering av sebrafisk embryo i 96-brønn format6. Noen former er tilpasset for visse stadier og kan ikke tillate Ubegrenset vekst for lang tidsperioder, mens andre formene er mer fleksible. Nylig, Weijts et al. publisert design og fabrikasjon av en fire-brønn parabolen for Live Imaging av sebrafisk embryo7. I denne parabolen, er halen og stammen av anesthetized fisk embryo plassert manuelt under en klar silikon tak festet like over et deksel glass for å danne en lomme. Fosteret blir deretter fast i denne posisjonen ved tilsetning av 0,4% agarose. Denne monteringen gjør det mulig for Imaging av ca 2 mm lang bakre del (trunk og hale) av fosteret, og som opp til 12 embryo kan monteres per brønn, gir metoden for Imaging av flere prøver. På samme måte, Hirsinger og Steventon nylig presentert en metode der leder av fisken er montert i agarose, mens halen kan fritt vokse, og denne metoden også effektivt forenkler Imaging av stammen og halen regionen av embryo8.
Denne artikkelen beskriver en lagdelt montering metode for sebrafisk embryo som begrenser bevegelsene til embryo samtidig gir for Ubegrenset vekst. Fordelene med denne monteringsmetoden er at det er en rimelig, rask og enkel metode for å montere embryo av ulike stadier for bildebehandling ved hjelp av noen invertert mikroskop. Monteringen tillater lang tids avbildning av hele kroppen (hode, stamme og hale) under utviklingen av embryo. For å vise frem brukbarheten av denne metoden, ble hele embryo vaskulær, neuronal og muskelutvikling avbildet i transgene fisk. To embryo per økt, på to bølgelengder i 3D ble avbildet av time-lapse mikroskopi for 55 sammenhengende timer for å gjengi filmer av vev utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives en monteringsmetode for utvidet tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi av hele sebrafisk embryo. Den mest kritiske skritt for montering metoden er å identifisere den optimale konsentrasjonen av agarose som vil tillate for ubegrenset sebrafisk embryo vekst, og samtidig holde embryo i en helt fast posisjon for konfokalmikroskopi Imaging. Fordi den optimale konsentrasjonen av agarose er veldig smal, er denne verdien svært følsom for feil i måling av vekten av agarose og volumet av E3 under utarbeidelse …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Albert pan og Arndt Sieakmann for gaver av transgene fisk. Vi takker Koichi Kawakami ved National Institute of genetikk, National BioResource Project fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan for gave de transgene sebrafisk HGn39b. Vi takker også Fatima Merchant og Kathleen Gajewski for assistanse på konfokalmikroskopi mikroskopi, og Tracey Theriault for fotografier.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Environmental Health Sciences i National Institutes of Health (Grant nummer P30ES023512 og kontraktnummer HHSN273201500010C). SU ble støttet av et fellesskap fra Keck beregningsorientert Cancer Biology program (Gulf Coast konsortier CPRIT Grant RP140113) og av Hugh Roy og Lillie legat fondet. J-å G ble støttet av Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Referências
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
