Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren
Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het kweken en analyseren van glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Deze methode kan worden gebruikt om trajecten te bestuderen die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie.
Abstract
Pariëtale epitheelcel (PEC) activering is een van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose. Remming van trajecten die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelactivering kan daarom een hulpmiddel zijn om de progressie van glomerulaire ziekten te verzachten. Dit artikel beschrijft een methode om te cultuur en analyseren pariëtale epitheelcel uitgroei van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Na het ontleden van geïsoleerde muizennieren wordt het weefsel gehakt en glomeruli geïsoleerd door te zeven. Ingekapselde glomeruli worden verzameld, en enkele glomeruli worden gekweekt voor 6 dagen tot glomerulaire uitgroei van pariëtale epitheelcellen te verkrijgen. Tijdens deze periode kunnen pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie worden geanalyseerd door het celgetal of het oppervlak van ontgroeiende cellen te bepalen. Deze test kan daarom worden gebruikt als een instrument om de effecten van een veranderde genexpressie bij transgene- of knock-outmuizen of de effecten van cultuuromstandigheden op pariëtale epitheelcelgroeikenmerken en signalering te bestuderen. Met behulp van deze methode kunnen belangrijke trajecten worden bestudeerd die betrokken zijn bij het proces van pariëtale epitheliale celactivering en bijgevolg bij glomerulosclerose.
Introduction
Glomerulaire ziekten zijn een belangrijke groep nieraandoeningen en vormen een belangrijke oorzaak van nierziekten in het eindstadium (ESRD). Helaas zijn specifieke behandelingsopties beperkt en is progressie naar ESRD onvermijdelijk. Glomerulaire ziekten worden gedefinieerd door de aanwezigheid van glomerulair letsel en kunnen worden gegroepeerd bij ontstekings- en niet-ontstekingsziekten. Hoewel de eerste belediging anders is, hebben recente studies aangetoond dat een gemeenschappelijk cellulair mechanisme leidt tot glomerulaire epitheliale celhyperplasie en uiteindelijk tot glomerulosclerose bij alle glomerulaire ziekten, ongeacht de onderliggende oorzaak1,2,3,4.
Concreet werd aangetoond dat glomermerosclerotische laesies voornamelijk bestaan uit geactiveerde pariëtale epitheelcellen5,6. Onder fysiologische omstandigheden zijn pariëtale epitheelcellen platte rustige epitheliale cellen die de Bowman’s capsule van de glomerulus belijnen. Echter, elke glomerulaire schade als gevolg van genetische mutaties (bijvoorbeeld podocyte specifieke of mitochondriale cytopathieën), ontsteking of hyperfiltratie (bijvoorbeeld veroorzaakt door verminderde niermassa, hypertensie, obesitas of diabetische mellitus) kan leiden tot de activering van pariëtale epitheelcellen. Geactiveerde pariëtale epitheelcellen vermenigvuldigen en deponeren extracellulaire matrix wat resulteert in de vorming van cellulaire halve maan of sclerotische laesies5,7,8. Progressie van deze processen resulteert in verlies van nierfunctie9. Daarom is pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke factor in de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose bij zowel ontstekings- als niet-inflammatoire glomerulare ziekten1,2,3,4,10.
De moleculaire processen die pariëtale epitheelcelactivering bemiddelen zijn nog grotendeels onbekend. Recente studies tonen aan dat geactiveerde pariëtale epitheelcellen de novo express CD44, een receptor die belangrijk is voor de activering van verschillende trajecten die betrokken zijn bij cellulaire proliferatie en migratie. Bovendien bleek dat remming van CD44 pariëtale epitheelcelactivering remt en de progressie van halve maanvorming en glomermerorose in diermodellen van ontstekings- en niet-inflammatoire glomerrale ziekten11,12.
Aangezien pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke speler is voor de ontwikkeling van glomerulosclerose en halve maanvorming, kan remming van deze cellen de progressie van glomerulaire ziekten vertragen. Opheldering van de moleculaire paden die pariëtale epitheelcelactivering stimuleren, kan leiden tot de ontwikkeling van specifieke therapeutische interventies die de vorming van de hyperplastische en glomerolosclerotische laesies bij glomerrale ziekte verzachten.
In experimentele diermodellen is het vaak moeilijk om bewijs te leveren voor een direct effect van een veranderde genexpressie (knock-outmodellen of transgene muismodellen) of medicamenteuze behandeling op de pariëtale epitheelcellen. Bij een conventionele knock-outmuis kunnen de waargenomen in vivo veranderingen worden verklaard door directe veranderingen in pariëtale epitheelcellen. Aangezien de genexpressie echter ook in andere celtypen binnen de muis wordt gewijzigd, kan men indirecte effecten die door andere celtypen worden bemiddeld, niet uitsluiten. De ontwikkeling van voorwaardelijke cre-lox muizen gedreven door promotors voornamelijk actief in pariëtale epitheelcellen heeft een oplossing in sommige gevallen13. Niettemin zijn voorwaardelijke transgene modellen complex en hoewel er meer voorwaardelijke lijnen beschikbaar komen, is er voor veel van de conventionele knock-out- of transgene muislijnen nog geen voorwaardelijk substituut.
Om de directe effecten op pariëtale epitheelcellen te bestuderen, heeft onze groep een ex vivo test ontwikkeld met behulp van enkele ingekapselde glomeruli geïsoleerd van muizennieren om pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie te meten en te analyseren. Deze methode zal ons in staat stellen om pariëtale epitheelcelspecifieke effecten te bepalen en verantwoordelijke trajecten te vinden voor pariëtale epitheelcelactivering en testbehandelingsopties om deze activering te remmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van het protocol beschreven in dit artikel, kan men gebruik maken van enkele ingekapselde glomeruli te evalueren pariëtale epitheelcelproliferatie die een gevolg is van pariëtale epitheelcel activering. Dit ex vivo model zal ons in staat stellen om in detail te bestuderen van de moleculaire trajecten, die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcel activering. De beschreven methode is gebaseerd op het eenvoudige concept van nierdissectie en zeven om glomeruli te isoleren en te kweken en te vergelijken en proli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door Dutch Kidney Foundation (subsidie 14A3D104) en NWO VIDI subsidie: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Referências
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
