Glomeruläres Outgrowth als Ex-Vivo-Assay zur Analyse von Pfaden, die an der Parietalepithel Cell Activation beteiligt sind
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung und Analyse glomerulären parietalen Epithelzellauswüchsen von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert sind. Diese Methode kann verwendet werden, um Wege zu untersuchen, die an der Proliferation und Migration von parietalen Epithelzellen beteiligt sind.
Abstract
Die Aktivierung der Parietalepithelzelle (PEC) ist einer der Schlüsselfaktoren, die an der Entwicklung und Progression der Glomerulosklerose beteiligt sind. Die Hemmung von Wegen, die an der Aktivierung parietaler Epithelzellen beteiligt sind, könnte daher ein Werkzeug sein, um das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen abzumildern. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultur und Analyse parietaler Epithelzellauswüchse von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert wurden. Nach der Sezieren isolierter Mausnieren wird das Gewebe gehackt, und Glomeruli werden durch Sieben isoliert. Verkapselte Glomeruli werden gesammelt, und einzelne Glomeruli werden für 6 Tage kultiviert, um ein glomeruläres Auswachsen von parietalen Epithelzellen zu erhalten. Während dieser Zeit kann die Verbreitung und Migration von parietalen Epithelzellen analysiert werden, indem die Zellzahl oder die Oberfläche der auswachsenden Zellen bestimmt wird. Dieser Assay kann daher als Werkzeug verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Genexpression bei transgenen oder Knockout-Mäusen oder die Auswirkungen von Kulturbedingungen auf parietale Epithelzellwachstumseigenschaften und Signalisierung zu untersuchen. Mit dieser Methode können wichtige Wege untersucht werden, die am Prozess der parietalen Epithelzellaktivierung und damit bei Glomerulosklerose beteiligt sind.
Introduction
Glomeruläre Erkrankungen sind eine wichtige Gruppe von Nierenerkrankungen und stellen eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) dar. Leider sind spezifische Behandlungsmöglichkeiten begrenzt, und der Übergang zum ESRD ist unvermeidlich. Glomeruläre Erkrankungen werden durch das Vorhandensein von glomerulären Verletzungen definiert und können in entzündlichen und nicht-entzündlichen Erkrankungen gruppiert werden. Obwohl die anfängliche Beleidigung anders ist, haben neuere Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer zellulärer Mechanismus zu glomerulärer Epithelzellhyperplasie und letztlich zu Glomerulosklerose bei allen glomerulären Erkrankungen führt, unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache1,2,3,4.
Insbesondere wurde gezeigt, dass glomerulosklerotische Läsionen hauptsächlich aus aktivierten parietalen Epithelzellen5,6bestehen. Unter physiologischen Bedingungen sind parietale Epithelzellen flache, ruhende Epithelzellen, die die Bowman-Kapsel des Glomerulus säumen. Jedoch kann jede glomeruläre Verletzung, die entweder auf genetische Mutationen (z. B. Podozytenspezifische oder mitochondriale Zytopathien), Entzündungen oder Hyperfiltrationen (z. B. verursacht durch verminderte Nierenmasse, Bluthochdruck, Fettleibigkeit oder diabetischen Mellitus) zurückzuführen sind, die Aktivierung parietaler Epithelzellen auslösen. Aktivierte parietale Epithelzellen vermehren sich und deponieren extrazelluläre Matrix, was zur Bildung von zellulären Halbmonken oder sklerotischen Läsionen5,7,8führt. Das Fortschreiten dieser Prozesse führt zum Verlust der Nierenfunktion9. Daher ist die Aktivierung der parietalen Epithelzellaktivierung ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung und das Fortschreiten der Glomerulosklerose bei entzündlichen und nicht-entzündlichen glomerulären Erkrankungen1,2,3,4,10.
Die molekularen Prozesse, die die Aktivierung parietaler Epithelzellen vermitteln, sind noch weitgehend unbekannt. Jüngste Studien zeigen, dass aktivierte parietale Epithelzellen de novo EXPRESS CD44, ein Rezeptor, der für die Aktivierung verschiedener Wege an der Zellproliferation und Migration beteiligt ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Hemmung von CD44 die aktivierung der parietalen Epithelzellaktivierung hemmt und das Fortschreiten der Halbmondbildung und Glomerulosklerose in Tiermodellen entzündlicher sowie nichtentzündlicher glomerulärer Erkrankungen11,12abmildert.
Da die Aktivierung der parietalen Epithelzellen ein wichtiger Akteur für die Entwicklung von Glomerulosklerose und Halbmondbildung ist, könnte die Hemmung dieser Zellen das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen verlangsamen. Die Aufklärung der molekularen Bahnen, die die Aktivierung parietaler Epithelzellen vorantreiben, kann zur Entwicklung spezifischer therapeutischer Interventionen führen, die die Bildung der hyperplastischen und glomeruloklerotischen Läsionen bei glomerulären Erkrankungen dämpfen.
In experimentellen Tiermodellen ist es häufig schwierig, Beweise für eine direkte Wirkung einer veränderten Genexpression (Knock-out-Modelle oder transgene Mausmodelle) oder einer medikamentösen Behandlung auf die parietalen Epithelzellen zu liefern. Bei einer herkömmlichen Knock-out-Maus können die beobachteten In-vivo-Veränderungen durch direkte Veränderungen in parietalen Epithelzellen erklärt werden. Da die Genexpression jedoch auch in anderen Zelltypen innerhalb der Maus verändert wird, kann man indirekte Effekte, die von anderen Zelltypen vermittelt werden, nicht ausschließen. Die Entwicklung von bedingten Cre-Lox-Mäusen, die von Promotoren angetrieben werden, die hauptsächlich in parietalen Epithelzellen aktiv sind, hat in einigen Fällen eine Lösung für13geliefert. Dennoch sind bedingte transgene Modelle komplex, und obwohl mehr bedingte Linien verfügbar werden, gibt es für viele der herkömmlichen Knock-out- oder transgenen Mauslinien noch keinen bedingten Ersatz.
Um die direkten Auswirkungen auf parietale Epithelzellen zu untersuchen, hat unsere Gruppe einen Ex-vivo-Assay mit einzelnen verkapselten Glomeruli entwickelt, die aus Mausnieren isoliert wurden, um die Proliferation und Migration parietaler Epithelzellen zu messen und zu analysieren. Diese Methode wird es uns ermöglichen, parietale epitheliale zellspezifische Effekte zu bestimmen und verantwortliche Wege für die Aktivierung parietaler Epithelzellen zu finden und Behandlungsoptionen zu testen, um diese Aktivierung zu hemmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll kann man einzelne gekapselte Glomeruli verwenden, um die parietale Epithelzellproliferation zu bewerten, die eine Folge der parietalen Epithelzellaktivierung ist. Dieses Ex-vivo-Modell wird es uns ermöglichen, die molekularen Bahnen, die an der parietalen Epithelzellaktivierung beteiligt sind, im Detail zu untersuchen. Die beschriebene Methode beruht auf dem einfachen Konzept der Nierensektion und Siebung, um verkapselte Glomeruli zu isolieren und zu kulturieren und die …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Niederländischen Nierenstiftung (Grant 14A3D104) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO VIDI-Stipendium: 016.156.363) unterstützt.
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Referências
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