בלתי מימדית כמו לשעבר שיטת Vivo לנתח מסלולים מעורב הקודקוד הקודקודית התא ההפעלה
Summary
מאמר זה מתאר שיטה עבור culturing וניתוח החוצה הקודקוד הקודקודית תא האפיתל של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מסלולים המעורבים התפשטות התא הקודקודית והגירה.
Abstract
תא האפיתל הקודקוד (הפעלה) הוא אחד הגורמים העיקריים המעורבים בפיתוח והתקדמות של טרשת נפוצה. עיכוב של מסלולים המעורבים ההפעלה התא אפיתל הקודקוד יכול אפוא להיות כלי כדי להחליש את ההתקדמות של מחלות פקפיות. מאמר זה מתאר שיטה לתרבות ולנתח את הצמיחה של תא אפיתל הקודקוד של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. לאחר ניתוח כליות מבודדות של העכבר, הרקמה היא כתוש, ו גלואראולי מבודדים על ידי ניפוי. פקאולי באנקפסולציה נאספים, ו פקולי בודד הם מתורבתים עבור 6 ימים כדי לקבל את הצמיחה של התאים הקודקודית של תאי אפיתל. במהלך תקופה זו, התפשטות הדופן הקודקודית והגירה ניתן לנתח על ידי קביעת מספר התא או שטח המשטח של תאים מתרחב. לפיכך, ניתן להשתמש באפשרות זו ככלי לחקר ההשפעות של ביטוי גנטי משתנה בטרנסגניים-או בעכברים או בהשפעות של תנאי התרבות על מאפייני הצמיחה של תאים אפיתל הקודקוד ואיתות. באמצעות שיטה זו, מסלולים חשובים המעורבים בתהליך של הפעלת תא אפיתל הקודקוד וכתוצאה מכך ניתן ללמוד טרשת נפוצה.
Introduction
מחלות פקבוליות הם קבוצה חשובה של הפרעות כליות ומייצגים הגורם העיקרי של מחלת כליות בשלב הסיום (ESRD). למרבה הצער, אפשרויות טיפול ספציפיות מוגבלות התקדמות כדי ESRD הוא בלתי נמנע. מחלות פקפיות מוגדרות על ידי נוכחות של פציעה פקפיות וניתן לקבץ במחלות דלקתיות ושאינן דלקתיות. למרות העלבון הראשוני הוא שונה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מנגנון הסלולר המשותף מוביל היפרפלזיה תאית האפיתל התאים ובסופו של דבר כדי גלולוולוטרשת בכל מחלות פקאיות, ללא קשר לגורם הבסיסי1,2,3,4.
באופן ספציפי, זה הוכח כי נגעים גלובליים מורכבים בעיקר של הפעלת תאים אפיתל הקודקוד5,6. התאים האפיתל הם שטוחים בתאים. שעומדים בתור הקפסולה של באומן עם זאת, כל פציעה גלובציט או בגלל מוטציות גנטיות (למשל, מסוים או cytopathies ספציפי או מיטוכונדריאלי), דלקת או היפרסינון (למשל, נגרמת על ידי מסה כליות מופחתת, יתר לחץ דם, השמנה או סוכרת) יכול להפעיל את ההפעלה של תאים אפיתל הקודקוד. תאי אפיתל הופעל הקודקוד מתרבים הפקדה לחילוץ מטריקס אשר תוצאות היווצרות של crescents סלולריים או נגעים מאוים5,7,8. ההתקדמות של תהליכים אלה גורמת לאובדן תפקוד הכליות9. לכן, ההפעלה תא אפיתל הקודקוד הוא גורם מפתח בפיתוח והתקדמות של טרשת נפוצה במחלות פקפיות דלקתיות ולא דלקתיות,1,2,3,4,10.
התהליכים המולקולריים של הפעלת תאי האפיתל הקודקודית עדיין אינם ידועים ברובו. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי הופעל תאים אפיתל הקודקוד דה נובו אקספרס CD44, קולטן כי חשוב להפעלת מסלולים שונים המעורבים התפשטות הסלולר והגירה. יתר על כן, עיכוב של CD44 הוכח לעכב את ההפעלה תא אפיתל הקודקוד והחליש את ההתקדמות של היווצרות הסהר לבין טרשת נפוצה במודלים של בעלי חיים של דלקת, כמו גם מחלות פקפיות דלקתיות לא דלקתית11,12.
כמו ההפעלה תא האפיתל הקודקוד הוא נגן מפתח לפיתוח של טרשת נפוצה והיווצרות הסהר, עיכוב של תאים אלה יכול להאט את ההתקדמות של מחלות פקפיות. ההסבר של מסלולים מולקולריים הנהיגה הקודקודית התא ההפעלה עלולה להוביל לפיתוח של התערבויות טיפוליות ספציפיות כי החליש את היווצרות של הנגעים hyperplastic ו גלובאפיללותטיות במחלות פקפיות.
בדגמי בעלי חיים ניסיוניים, קשה לעתים קרובות לספק ראיות להשפעה ישירה של ביטוי גנטי משתנה (מודלים של מודלים או העכבר הטרנסגניים) או טיפול תרופתי בתאי האפיתל הקודקודית. בתוך העכבר הרגיל להוריד את הנצפים שינויים vivo עשוי להיות מוסבר על ידי שינויים ישירים בתאי אפיתל הקודקוד. עם זאת, מאחר שביטוי הגנים משתנה גם בסוגי תאים אחרים בתוך העכבר, אין אפשרות לכלול אפקטים עקיפים המתווכת על-ידי סוגי תאים אחרים. התפתחות של עכברים מותנה -לקס מונע על ידי יזמים פעילים בעיקר בתאי אפיתל הקודקוד סיפק פתרון במקרים מסוימים13. עם זאת, מודלים טרנסגניים מותנים הם מורכבים ולמרות שקווים מותנים יותר הופכים לזמינים, עבור רבים מקווי העכבר הרגילים או הטרנסגניים, אין עדיין תחליף מותנה.
כדי ללמוד את ההשפעות הישירות על התאים האפיתל הקודקודית, הקבוצה שלנו פיתחה שיטת vivo ex באמצעות בודד כדורית לשעבר מבודדים מכליות העכבר כדי למדוד ולנתח את התפשטות התא אפיתל הקודקוד והגירה. שיטה זו תאפשר לנו לקבוע הקודקודית תא האפיתל אפקטים ספציפיים כדי למצוא מסלולים אחראיים ההפעלה התא אפיתל הקודקוד ולבדוק אפשרויות טיפול כדי לעכב את ההפעלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, ניתן להשתמש באחד לפקולי שעברו שימוש בודד כדי להעריך את התפשטות התא אפיתל הקודקוד שהיא תוצאה של הפעלת תא אפיתל הקודקוד. זה מודל vivo ex יאפשר לנו ללמוד בפירוט מסלולים מולקולריים, אשר מעורבים ההפעלה התא אפיתל הקודקוד. השיטה המתוארת מתבססת על המושג הפשוט של ני?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן כליות הולנדית (גרנט 14A3D104) ואת הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO VIDI מענק: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Referências
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
