Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali
Summary
Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.
Abstract
L’attivazione delle cellule epiteliali parietali (PEC) è uno dei fattori chiave coinvolti nello sviluppo e nella progressione della glorulosclerosi. L’inibizione delle vie coinvolte nell’attivazione delle cellule epiteliali parietali potrebbe quindi essere uno strumento per attenuare la progressione delle malattie glomerari. Questo articolo descrive un metodo per coltura e analizzare la crescita delle cellule epiteliali parietali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Dopo aver sezionato i reni di topo isolati, il tessuto viene macinato e i glomeruli vengono isolati dalla setacciatura. I glomeruli incapsulati vengono raccolti e i glomeruli singoli vengono coltivati per 6 giorni per ottenere la crescita glomerare delle cellule epiteliali parietali. Durante questo periodo, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali possono essere analizzate determinando il numero di cellule o la superficie delle cellule in crescita in emigrazione. Questo saggio può quindi essere utilizzato come strumento per studiare gli effetti di un’espressione genica alterata nei topi transgenici o knockout o gli effetti delle condizioni di coltura sulle caratteristiche e la segnalazione della crescita delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questo metodo, è possibile studiare importanti vie coinvolte nel processo di attivazione delle cellule epiteliali parietali e, di conseguenza, nella glomerulosclerosi.
Introduction
Le malattie glomeriari sono un importante gruppo di disturbi renali e rappresentano una delle principali cause della malattia renale allo stadio finale (ESRD). Sfortunatamente, le opzioni di trattamento specifiche sono limitate e la progressione verso l’ESRD è inevitabile. Le malattie glomerari sono definite dalla presenza di lesioni glomeriule e possono essere raggruppate in malattie infiammatorie e non infiammatorie. Anche se l’insulto iniziale è diverso, studi recenti hanno dimostrato che un meccanismo cellulare comune porta a iperplasia delle cellule epiteliali glomerale e, infine, alla glomerulosclerosi in tutte le malattie glomerari, indipendentemente dalla causa sottostante1,2,3,4.
In particolare, è stato dimostrato che le lesioni glomerulosclerotice sono composte principalmente da cellule epiteliali parietali attivate5,6. In condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali parietali sono cellule epiteliali quiescenti piatte che riallineano la capsula del Bowman del glomerulus. Tuttavia, qualsiasi lesione glomerare dovuta a mutazioni genetiche (ad esempio, citopatie specifiche di podociti o mitocondriali), infiammazione o iperfiltrazione (ad esempio, causata da ridotta massa renale, ipertensione, obesità o mellito diabetico) può innescare l’attivazione delle cellule epiteliali parietali. Le cellule epiteliali parietali attive proliferano e depositano matrice extracellulare che si traduce nella formazione di mezzalune cellulari o lesioni sclerotiche5,7,8. La progressione di questi processi comporta la perdita della funzione renale9. Pertanto, l’attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo e nella progressione della glomerulosclerosi nelle malattie glomerari sia infiammatorie che non infiammatorie1,2,3,4,10.
I processi molecolari che mediano l’attivazione delle cellule epiteliali parietali sono ancora in gran parte sconosciuti. Recenti studi dimostrano che le cellule epiteliali parietali attivate de novo esprimono CD44, un recettore importante per l’attivazione di diversi percorsi coinvolti nella proliferazione cellulare e nella migrazione. Inoltre, l’inibizione del CD44 ha dimostrato di inibire l’attivazione delle cellule epiteliali parietali e attenuare la progressione della formazione della mezzaluna e della glomerulosclerosi nei modelli animali di malattie glomerari e infiammatorie11,12.
Poiché l’attivazione delle cellule epiteliali parietali è un attore chiave per lo sviluppo della glomerulsclerosi e della formazione della mezzaluna, l’inibizione di queste cellule potrebbe rallentare la progressione delle malattie glomerari. La chiarificazione delle vie molecolari che determinano l’attivazione delle cellule epiteliali parietali può portare allo sviluppo di interventi terapeutici specifici che attenuano la formazione delle lesioni iperplastiche e glomerulosclerotice nella malattia glomerare.
Nei modelli animali sperimentali, è spesso difficile fornire prove di un effetto diretto di un’espressione genica alterata (modelli di eliminazione o modelli murini transgenici) o di un trattamento farmacologico sulle cellule epiteliali parietali. In un topo knock-out convenzionale i cambiamenti osservati in vivo potrebbero essere spiegati da cambiamenti diretti nelle cellule epiteliali parietali. Tuttavia, poiché l’espressione genica è alterata anche in altri tipi di cellule all’interno del mouse, non si possono escludere gli effetti indiretti mediati da altri tipi di cellule. Lo sviluppo di topi condizionati cre-lox guidati da promotori attivi principalmente in cellule epiteliali parietali ha fornito una soluzione in alcuni casi13. Tuttavia, i modelli transgenici condizionali sono complessi e, anche se diventano disponibili linee più condizionali, per molte delle linee di topo convenzionali knock-out o transgeniche non esiste ancora un sostituto condizionale.
Per studiare gli effetti diretti sulle cellule epiteliali parietali, il nostro gruppo ha sviluppato un saggio ex vivo utilizzando glomeruli singoli incapsulati isolati dai reni dei topi per misurare e analizzare la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo ci permetterà di determinare gli effetti specifici delle cellule epiteliali parietali e di trovare vie responsabili per l’attivazione delle cellule epiteliali parietali e testare le opzioni di trattamento per inibire questa attivazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare glomeruli singoli incapsulati per valutare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali che è una conseguenza dell’attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo modello ex vivo ci permetterà di studiare in dettaglio i percorsi molecolari, che sono coinvolti nell’attivazione delle cellule epiteliali parietali. Il metodo descritto si basa sul semplice concetto di dissezione renale e setacciatura per isolare e coltura incapsul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla fondazione rene olandese (sovvenzione 14A3D104) e dall’Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO VIDI grant: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Referências
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