הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות
Summary
ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.
Abstract
תאי גזע עובריים האדם להפגין יכולת ייחודית להגיב מורפולגנים בחוץ גופית על ידי דפוסי ארגון עצמי של מפרט הגורל התא המתאימות היווצרות שכבת הנבט העיקרי במהלך embryogenesis. לפיכך, תאים אלה מייצגים כלי רב-עוצמה שעליו לבחון את המנגנונים שנוהגים בהתפתחות האנושית המוקדמת. פיתחנו שיטה לתרבות האדם תאים גזע עובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי המספק שליטה על הגיאומטריה של המושבות הסביבה המכנית שלהם כדי ללכוד את הפרמטרים הפיזיים ש embryogenesis. התכונה המפתח של שיטה זו היא היכולת לייצר הידרואקרילאמיד polyג’לים עם דפוסים מוגדרים של מטריקס ליגתאי מטריצות על פני השטח כדי לקדם את הקובץ המצורף לתא. זה מושגת על ידי בדיית סטנסילים עם דפוסים גיאומטריים הרצוי, באמצעות סטנסילים אלה כדי ליצור דפוסים של מטריקס ליגתאי מטריצה על שמיכות זכוכית, והעברת דפוסים אלה להידרואקרילאמיד הידרוג’לים במהלך הפלוניזציה. שיטה זו תואמת גם עם מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשר למשתמש למדוד ולמפות את התפלגות הכוחות המופקים התא בתוך המושבות הסגורים. בשילוב עם מידות ביוכימיות סטנדרטיות, ניתן להשתמש במידות אלה כדי לבחון את מספר הסימנים המכאניים במפרט הגורל ומורפולגנזה במהלך התפתחות האדם הקדומה.
Introduction
האדם תאים גזע עובריים (hESCs) להחזיק הבטחה גדולה לשימוש ברפואה משובי ויישומים הנדסה רקמות. האופי הפלוריאני של התאים האלה נותן להם את היכולת להבדיל לכל סוג של תא מבוגר. בעוד צעדים גדולים נעשו בבימוי גורלם של hESCs לסוגי תאים מסוימים, זה נשאר קשה מאוד לייצר רקמות שלמות או איברים דה נובו1,2,3,4, 5. המשך הדבר נובע, במידה רבה, להבנה מוגבלת של המנגנונים הנוהגים ביצירת רקמות אלה במהלך התפתחות האדם. כדי למלא את הפער הזה בידע, מספר שיטות הופיעו בשנים האחרונות כדי לדגמן את העובר המוקדם ובשלבים הבאים של פיתוח עם תאי גזע עובריים6,7,8,9 ,10,11,12,13.
זמן קצר לאחר הנגזרת של קווי hESC הראשון14, זה הוכח כי גופים embryoid נוצר מ hESCs היו מסוגלים לייצר באופן ספונטני תאים של שלוש שכבות הנבט הראשי6. עם זאת, בשל חוסר השליטה הטבועה בגודל ומורפולוגיה של גופים embryoid, הארגון של שכבות הנבט מגוונות באופן משמעותי ונכשל להתאים את הארגון של העובר המוקדם. לאחרונה, חימום פלאש et al. פיתחה שיטה להגבלת מושבות של hESCs על מצעים זכוכית באמצעות מיקרופיקנינג, מתן שליטה ועקביות על הגודל והגיאומטריה של המושבות8. בנוכחות BMP4, מורפוגן חשוב בהתפתחות מוקדמת, אלה מושבות מוגבלים היו מסוגלים לארגון העצמי דפוסים מסוימים של מפרט לגורלות המייצגים את שכבות הנבט העיקרי. למרות שזה סיפק מודל שימושי ללמוד את המנגנונים שבהם שכבות הנבט העיקרי מבוססים, דפוסי מפרט הגורל לא התאימו בדיוק את הארגון ואת מורפולגנזה נצפתה במהלך embryogenesis15. לכידה נאמנה יותר של התפתחות עובריים מוקדם הושגה על ידי הטבעת hESCs במטריצה תלת ממדית החילוץ (ECM) של מטריקס11, מתן הראיות החזק ביותר עד כה על היכולת של hESCs לארגן ולדגמן מודל השלבים המוקדמים של embryogenesis ex vivo. עם זאת, שיטה זו מפיקה תוצאות לא עקביות ולכן היא אינה תואמת למספר דרישות שניתן להשתמש בה כדי לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של הארגון העצמי ומפרט הגורל.
בהינתן אלה השיטות הקיימות ואת המגבלות המתאימות שלהם, חיפשנו לפתח שיטה המתספשות culturing מושבות hESC של גיאומטריות מוגדר בתנאים המודל את הסביבה החילוץ של העובר המוקדם. כדי להשיג את זה, השתמשנו אלקטרופורזה הידרוג’לים של אלסטיות מסוגל לשלוט על תכונות מכניות של המצע. בעזרת מיקרוסקופ כוח אטומי על עוברי העוף הבמה-שלב, מצאנו כי האלסטיות של אפיהפיצוץ נע בין מאות משתמשים בעלי משקפיים לכמה קילו-מיימת. לכן, אנו מתמקדים ביצירת הידרואקרילאמיד polyג’לים עם אלסטיות בטווח הזה כדי לשמש את המצע עבור המושבות hESC. שנינו את השיטות הקודמות שלנו עבור culturing hESCs על אלקטרופורזה הידרוג’ל7,9 כדי לספק שליטה איתנה על הגיאומטריה של המושבות. השגנו זאת על ידי הראשון המכונה ECM ליגנדס, כלומר מטריצות, על שמיכות זכוכית באמצעות סטנסילים מיקרו מפוברק, כפי שדווח בעבר16. לאחר מכן עיצבנו טכניקה מקורית כדי להעביר את הליגלים ולמשטח ההידרואקרילאמיד בזמן הפילמור. השיטה שאנו מתארים כאן כרוכה בשימוש פוטוגרפיה כדי לייצר וופל סיליקון עם דפוסים גיאומטריים הרצוי, יצירת בולים של תכונות גיאומטריות של תזות עם polydiמתיל siloxane (pdms), ושימוש בולים אלה כדי ליצור את הסטנסילים ש בסופו של דבר לאפשר מתקן של ליגנד על פני השטח של כיסוי זכוכית העברה polyacrylamide.
בנוסף על הפיכת הסביבה המכנית של העובר המוקדם, הקמת מושבות hesc על אלקטרופורזה מאפשר את המדידה של כוחות שנוצרו בתא עם מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm), כפי שדווח בשיטה הקודמת שלנו9. בקצרה, חרוזי פלורסנט יכול להיות מוטבע פוליאקרילמיד ומשמש סמנים fiducial. הכוחות שנוצר התא מחושבים על ידי הדמיה העקירה של חרוזים אלה לאחר זריעת hESCs על מצע בדוגמת. יתר על כן, כתוצאה מכך מפות כוח המתיחה יכול להיות משולב עם assays מסורתי, כגון מכתים, כדי לבחון כיצד התפלגות של כוחות התא שנוצר מושבות hESC המוגבלת עשוי לווסת או לווסת איתות במורד הזרם. אנו מצפים שיטות אלה יחשפו כי כוחות מכניים לשחק תפקיד קריטי בתוך המפרט של מפרט הגורל התא במהלך הפיתוח העובריים המוקדמים, כי הוא התעלמו כעת.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לפשט פרוטוקול ארוך ומפורט, שיטה זו מורכבת משלושה שלבים קריטיים: 1) יצירת תבניות של ecm ליגנד על כיסוי זכוכית, 2) העברת הדפוסים להידרואקרילאמיד במהלך פולימוניזציה של ג’ל, ו 3) זריעה hESCs על ה בדוגמת הידרוג’ל. ישנם שלבים קריטיים שיש להתחשב בהם בכל אחד משלושת השלבים הללו. על מנת ליצור דפוסים בעלי …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוני לאשר מימון מ-CIRM גרנט RB5-07409. J.M.M. רוצה להודות FuiBoon Kai, Dhruv Thakar, ו רוג’ר ריה עבור דיונים שונים שהדריך את הדור ופתרון בעיות של שיטה זו. J.M.M. גם תודה מלגת הגילוי של מדינת קליפורניה לתמיכה המתמשכת של עבודתו.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Referências
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
