Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Jonathon  M. Muncie; Roberto Falcón-Banchs; Johnathon  N. Lakins; Lydia  L. Sohn; Valerie  M. Weaver

doi:10.3791/60334

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Artigo de método

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

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DOI:

10.3791/60334

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28 de setembro de 2019

Jonathon M. Muncie¹^,² , Roberto Falcón-Banchs¹ , Johnathon N. Lakins² , Lydia L. Sohn¹^,³ , Valerie M. Weaver²^,⁴^,⁵^,⁶

¹Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, ²Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, ³Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, ⁴Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, ⁵UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, ⁶Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

Neste artigo

Resumo

Os ligantes da matriz extracellular podem ser modelados em hidrogéis do poliacrilamida para permitir a cultura de pilhas de haste embrionário humanas em colônias confinadas em carcaças complacentes. Este método pode ser combinado com a microscopia da força da tração e os ensaios bioquímicos para examinar o interação entre a geometria do tecido, as forças pilha-geradas, e a especificação do Fate.

Resumo

As células-tronco embrionárias humanas demonstram uma capacidade única de responder a morfogênios in vitro por padrões de autoorganização da especificação de destino celular que correspondem à formação de camada germinativa primária durante a embriogênese. Assim, essas células representam uma ferramenta poderosa com a qual examinar os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento humano precoce. Desenvolvemos um método para cultura de células-tronco embrionárias humanas em colônias confinadas em substratos complacentes que fornecem controle sobre a geometria das colônias e seu ambiente mecânico, a fim de recapitular os parâmetros físicos que embriogênese fundamentam. A característica chave deste método é a habilidade de gerar hidrogéis do poliacrilamida com testes padrões definidos do ligante extracelular da matriz na superfície para promover o acessório da pilha. Isto é conseguido fabricando stencils com os padrões geométricos desejados, usando esses estênceis para criar padrões de ligante de matriz extracelular em coberturas de vidro, e Transferindo esses padrões para hidrogéis de poliacrilamida durante a polimerização. Este método também é compatível com a microscopia de força de tração, permitindo ao usuário medir e mapear a distribuição de forças geradas por células dentro das colônias confinadas. Em combinação com ensaios bioquímicos padrão, essas medições podem ser usadas para examinar o papel que as pistas mecânicas desempenham na especificação do destino e na morfogênese durante o desenvolvimento humano precoce.

Introdução

Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) possuem grande promessa para uso em aplicações de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos. A natureza pluripotente destas células dá-lhes a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula adulta. Enquanto grandes avanços foram feitos na direção do destino de hESCs a tipos de células particulares, manteve-se muito difícil de gerar tecidos inteiros ou órgãos de novo¹^,²^,^3,4^,a ⁵. Isto é devido, em grande parte, a uma compreensão limitada dos....