Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto
Summary
I ligandi a matrice extracellulare possono essere modellati su idrogel di poliacrilammide per consentire la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi. Questo metodo può essere combinato con la microscopia a forza di trazione e i saggi biochimici per esaminare l’interazione tra la geometria dei tessuti, le forze generate dalle cellule e le specifiche del destino.
Abstract
Le cellule staminali embrionali umane dimostrano una capacità unica di rispondere ai morfogeni in vitro mediante modelli auto-organizzanti di specifiche del destino cellulare che corrispondono alla formazione primaria dello strato germinale durante l’embriogenesi. Così, queste cellule rappresentano un potente strumento con cui esaminare i meccanismi che guidano il primo sviluppo umano. Abbiamo sviluppato un metodo per la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi che fornisce il controllo sia sulla geometria delle colonie che sul loro ambiente meccanico al fine di ricapitolare i parametri fisici che embriogenesi. La caratteristica chiave di questo metodo è la capacità di generare idrogel di poliacrilammide con modelli definiti di legamento matrice extracellulare in superficie per promuovere l’attaccamento cellulare. Ciò si ottiene fabbricando stencil con i motivi geometrici desiderati, utilizzando questi stencil per creare modelli di ligando a matrice extracellulare su coperchi di vetro, e trasferendo questi modelli agli idrogel poliacrilamiti durante la polimerizzazione. Questo metodo è anche compatibile con la microscopia a forza di trazione, consentendo all’utente di misurare e mappare la distribuzione delle forze generate dalle cellule all’interno delle colonie confinate. In combinazione con i saggi biochimici standard, queste misurazioni possono essere utilizzate per esaminare il ruolo dei segnali meccanici nelle specifiche del destino e nella morfogenesi durante lo sviluppo umano precoce.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (HESC) sono molto promettenti per l’uso nella medicina rigenerativa e nelle applicazioni di ingegneria tissutale. La natura pluripotente di queste cellule dà loro la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula adulta. Mentre sono stati fatti grandi passi avanti nel dirigere il destino degli hESC verso particolari tipi di cellule, è rimasto molto difficile generare tessuti interi o organi de novo1,2,3,4, 5. Ciò è dovuto, in gran parte, ad una comprensione limitata dei meccanismi che guidano la formazione di questi tessuti durante lo sviluppo umano. Al fine di colmare questa lacuna nella conoscenza, negli ultimi anni sono emersi diversi metodi per modellare l’embrione precoce e le successive fasi di sviluppo con cellule staminali embrionali6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Poco dopo la derivazione delle prime linee hESC14, è stato dimostrato che i corpi embrionali formati da hESC erano in grado di produrre spontaneamente cellule dei tre strati germinali primari6. Tuttavia, a causa della mancanza intrinseca di controllo sulle dimensioni e la morfologia dei corpi embrionali, l’organizzazione degli strati germinali variava in modo significativo e non corrispondeva all’organizzazione dell’embrione precoce. Più recentemente, Warmflash ealtri ha sviluppato un metodo per confinare colonie di hESC su substrati di vetro tramite micropatterning, fornendo controllo e coerenza sulle dimensioni e la geometria delle colonie8. In presenza di BMP4, un importante morfogeno nello sviluppo iniziale, queste colonie confinate erano in grado di auto-organizzare modelli riproducibili di specificazione per i destini che rappresentano gli strati germinali primari. Anche se questo ha fornito un modello utile per studiare i meccanismi con cui vengono stabiliti gli strati germinali primari, i modelli di specifica del destino non corrispondevano esattamente all’organizzazione e alla morfogenesi osservate durante l’embriogenesi15. Una ricapitolazione più fedele dello sviluppo embrionale precoce è stata ottenuta incorporando hESC in una matrice extracellulare tridimensionale (ECM) di matrigel11, fornendo la prova più forte fino ad oggi per la capacità degli hESC di auto-organizzarsi e modellare primi stadi dell’embriogenesi ex vivo. Tuttavia, questo metodo produce risultati incoerenti ed è quindi incompatibile con una serie di saggi che potrebbero essere utilizzati per rivelare i meccanismi sottostanti di auto-organizzazione e specifica del destino.
Dati questi metodi esistenti e le rispettive limitazioni, abbiamo cercato di sviluppare un metodo per la coltura riproducibil di hESC colonie di geometrie definite in condizioni che modellano l’ambiente extracellulare del primo embrione. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo usato idrogel di poliacrilammide di elasticità regolabile per controllare le proprietà meccaniche del substrato. Utilizzando la microscopia a forza atomica sugli embrioni di pollo in stadio di gasastrulation, abbiamo scoperto che l’elasticità dell’epiblasto variava da centinaia di pascal a pochi chilodi. Così, ci siamo concentrati sulla generazione di idrogel di poliacrilammide con elasticità in questa gamma per servire come substrato per le colonie hESC. Abbiamo modificato i nostri metodi precedenti per la coltura di hESC su idrogel poliacrilammide7,9 per fornire un controllo robusto sulla geometria delle colonie. Abbiamo ottenuto questo modellando i ligandi ECM, vale a dire matrigel, su coperture in vetro attraverso stencil microfabbricati, come precedentemente riportato16. Abbiamo quindi progettato una nuova tecnica per trasferire il ligando modellato sulla superficie degli idrogel di poliacrilammide durante la polimerizzazione. Il metodo che qui descriviamo prevede l’utilizzo della fotolitografia per fabbricare un wafer di silicio con i motivi geometrici desiderati, creando timbri di tesi geometriche con polidimetilsiloxane (PDMS), e utilizzando questi francobolli per generare gli stencil che consentire infine la modellata del ligando sulla superficie di vetro coverslips e il trasferimento alla poliacrilammide.
Oltre a riassumere l’ambiente meccanico dell’embrione precoce, confinare le colonie di hESC sulla poliacrilammide consente la misurazione delle forze generate dalle cellule con la microscopia della forza di trazione (TFM), come riportato nel nostro metodo precedente9. In breve, le perle fluorescenti possono essere incorporate nella poliacrilammide e utilizzate come marcatori fiduciari. Le forze generate dalle cellule sono calcolate mediante l’imaging dello spostamento di queste perline dopo la semina di hESC sul substrato modellato. Inoltre, le mappe delle forze di trazione risultanti possono essere combinate con i saggi tradizionali, come l’immunostaining, per esaminare come la distribuzione delle forze generate dalle cellule nelle colonie hESC confinate possa regolare o modulare la segnalazione a valle. Ci aspettiamo che questi metodi rivelino che le forze meccaniche svolgono un ruolo critico nella modellina delle specifiche del destino cellulare durante lo sviluppo embrionale precoce che è attualmente trascurato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per semplificare un protocollo lungo e dettagliato, questo metodo consiste in tre fasi critiche: 1) la generazione di modelli di ligando ECM su coperchi in vetro, 2) trasferendo i modelli agli idrogel di polimembrana metà durante la polimerizzazione del gel, e 3) seeding hESC sul idrogel a motivi geometrici. Ci sono passi critici che devono essere considerati in ciascuna di queste tre fasi. Per generare modelli ad alta fedeltà sui coperchi di vetro, lo stencil deve essere saldamente premuto sul coperchio per evitare pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere i finanziamenti della sovvenzione CIRM RB5-07409. J.M.M. ringrazia FuiBoon Kai, Dhruv Thakar e Roger Oria per varie discussioni che hanno guidato la generazione e la risoluzione dei problemi di questo metodo. J.M.M. ringrazia anche la UCSF Discovery Fellowship per il continuo supporto del suo lavoro.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Referências
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