אנו מציגים שיטת הזרמה cy, כדי לזהות בו סוגי תאים שונים שאוחזרו ממוח העכבר או חוט השדרה. שיטה זו יכול להיות מנוצל כדי לבודד או לאפיין אוכלוסיות תאים טהורה במחלות ניווניות או לכמת את היקף המיקוד של התא על vivo ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים.
ההתקדמות האחרונה ב וקטורים וקטוריים ומדעי הננו פתחו את הדרך לגישות חדשניות לקידום החקירה או לטיפול במערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, אופטימיזציה נוספת של טכנולוגיות אלה היה להפיק תועלת מהשיטות המאפשרות מהירה ולייעל את היקף מידת המיקוד הספציפי לתא על ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים בגוף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מנצל את התפוקה הגבוהה ואת יכולות ריבוב של זרימה cy, נסה לאפשר כימות ישירה של תת תאים שונים מבודדים ממוח העכבר או חוט השדרה, כלומר microglia/מקרופאגים, לימפוציטים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך, נוירונים ותאי אנדותל. אנו מיישמים גישה זו כדי להדגיש הבדלים קריטיים בין שתי שיטות הומוקות רקמות במונחים של התשואה התא, הכדאיות והקומפוזיציה. הדבר יכול להורות למשתמש לבחור את השיטה הטובה ביותר בהתאם לסוג התא (ים) של עניין וליישום הספציפי. שיטה זו אינה מתאימה לניתוח של התפלגות אנטומית, שכן הרקמה היא הומוגניים כדי ליצור השעיה תא בודד. עם זאת, הוא מאפשר לעבוד עם תאים קיימא והוא יכול להיות משולב עם מיון תאים, פתיחת הדרך עבור מספר יישומים שיכולים להרחיב את הרפרטואר של כלים בידיים של נוירומדען, החל הקמת התרבויות הראשיות נגזר אוכלוסיות תאים טהורים, לניתוח גנים ביטוי ביוכימיים או פונקציונלי מוגדר על תת-מוגדרים היטב תאים בהקשר של מחלות ניווניות, על טיפול תרופתי או טיפול גנטי.
ג’ין וטכנולוגיות משלוח התרופה (כגון וקטורים וקטורי חלקיקים) הפכו כלי רב עוצמה שניתן להחיל כדי להשיג תובנות טובות יותר על מסלולים מולקולריים ספציפיים שונה במחלות ניווניות ולפיתוח גישות טיפוליות חדשניות1,2,3. אופטימיזציה של כלים אלה מסתמך על כימות של: (1) את היקף החדירה בתוך ה-CN על נתיבי שונים של ניהול ו (2) פילוח של אוכלוסיות תאים ספציפיות. ניתוחים היסטלוגיים מוחלים בדרך כלל על הדמיה של הכתב הפלורסנט גנים או fluorescently אופן מתויג חלקיקים באזורים שונים של המרכז העצמי ועל פני סוגי תאים שונים, מזוהה על ידי כתמים חיסוני עבור סמנים תא ספציפיים4,5. למרות גישה זו מספקת מידע רב ערך על ההתפלגות הביומלית של הגן המנוהל או כלי משלוח התרופות, הטכניקה יכולה להיות גוזלת זמן עבודה אינטנסיבית מאז שהוא דורש: (1) קיבוע רקמות, הקפאה או פרפין-הטבעה וחותך; (2) כתמים עבור סמנים סלולריים ספציפיים לעתים דורשים אחזור אנטיגן; (3) רכישה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, אשר בדרך כלל מאפשר ניתוח של מספר מוגבל של סמנים שונים בתוך אותו ניסוי; (4) עיבוד תמונה כדי לאפשר קוונפיקציה נאותה של אות הריבית.
הפכה cy, להיות טכניקה בשימוש נרחב אשר מנצל סמני פלורסנט ספציפיים מאוד כדי לאפשר לא רק הערכה כמותית מהירה של פנוטיפים תא שונים בשעיות התא, מבוסס על הביטוי של אנטיגנים או משטחים, אלא גם מדידות תפקודית (g., שיעור של אפופטוזיס, התפשטות, ניתוח מחזור התא, וכו ‘). בידוד פיזי של תאים באמצעות פלורסנט מופעל מיון התא אפשרי גם, המאפשר במורד הזרם יישומים (למשל, תרבות התא, RNAseq, ניתוחים ביוכימיים וכו ‘) . שש,שבע,שמונה
המגון רקמה היא צעד קריטי הכרחי כדי לקבל השעיית תא בודד כדי לאפשר אמין ומלא להזרים הערכות בזרם הסייטומטרימטרי. שיטות שונות תוארו עבור למבוגרים רקמת המוח המגון, בעיקר עם המטרה לבודד תאים מיקרוגלייה9,10,11; הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי בשתי קטגוריות עיקריות: (1) דיסוציאציה מכנית, אשר משתמשת שחיקה או הטיית כוח באמצעות הומוגניד Dounce (DH) כדי לקרוע את התאים מתוך נישות שלהם וליצור הבולם הומוגניים באופן יחסי הולם התא היחיד, ו (2) העיכול האנזימטי, המסתמך על דגירה של נתחי רקמות טחון ב-37 ° c בנוכחות אנזימים בעלי חרדה, כגון טריפסין או פאפאין, העדפה על השפלה של המטריצה המגמטית ליצור השעיית תאים הומוגניים למדי12.
ללא קשר לשיטה מנוצל, צעד טיהור מומלץ לאחר המגון רקמות להסיר את המיאלין דרך צנטריפוגה על הדרגתי צפיפות או על ידי בחירה מגנטית9,12, לפני המעבר יישומים במורד הזרם.
כאן, אנו מתארים שיטת עיבוד רקמות מבוסס על העיכול פפאין (PD) ואחריו טיהור על הדרגתי צפיפות, אופטימיזציה כדי להשיג השעיות תא הטרוגנית קיימא ממוח העכבר או חוט השדרה באופן רגיש זמן ומתאים לזרימה cy, try. יתר על כן, אנו מתארים 9-צבע הפאנל cy, לנסות את האסטרטגיה שאימצנו במעבדה כדי לאפשר את האפליה הסימולטני של אוכלוסיות שונות של ה-CN, חי/מת תאים או חיוביות עבור כתבים פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק או צבע rhodamine. על-ידי החלת ניתוח זה של הזרימה, אנו יכולים להשוות שיטות שונות של עיבוד רקמות, כלומר, PD מול DH, מבחינת שימור הכדאיות התאית ותשואות של סוגי תאים שונים.
הפרטים שאנו מספקים במסמך זה יכולים להורות על החלטה על פרוטוקול המגון ושילוב הנוגדן לשימוש בלוח הזרימה cy, מבוסס על סוג תא (ים) מסוים של עניין וניתוח במורד הזרם (g., רגישות לטמפרטורה יישומים, מעקב אחר סמני פלורסנט ספציפיים, בתרבות חוץ גופית, ניתוחים פונקציונליים).
כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח שיתוף טיהור וזרימה במקביל של חלק מתאי ה-CN הרלוונטיים ממוח העכבר וחוט השדרה. באופן מסורתי, ניתוחים היסטולוגיים הוחלו כדי לתאר את התפלגות חלקיקים או את היעילות התמרה של וקטורים ויראליות ב-cn5,13, או כדי לספק תובנות על שינויים מורפו…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי כספי הסטארט-up של בית החולים לילדים של בוסטון א יהושע, ALSA גרנט nr. 17-IIP-343 כדי לעשות זאת, והמשרד של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות באמצעות תוכנית המחקר טרשת לרוחב Amyotrophic תחת הפרס לא. W81XWH-17-1-0036 ל-שוטרים אנו מכירים DFCI זרימה Cysupport ליבה לתמיכה טכנית.
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |