Samtidige Flow analytiske karakterisering av flere celletyper Hentet fra mus Brain/ryggmarg gjennom ulike homogenisering metoder
Summary
Vi presenterer en Flow flowcytometri metode for å identifisere samtidig ulike celletyper Hentet fra mus hjernen eller ryggmargen. Denne metoden kan utnyttes til å isolere eller karakterisere rene celle populasjoner i nevrodegenerative sykdommer eller for å kvantifisere omfanget av celle målretting ved in vivo administrasjon av viral vektorer eller nanopartikler.
Abstract
Nylige fremskritt i viral vektor og nanomaterialebasert vitenskaper har åpnet veien for nye cutting-edge tilnærminger til å undersøke eller manipulere sentralnervesystemet (CNS). Men ytterligere optimalisering av disse teknologiene vil dra nytte av metoder som tillater rask og effektivisere fastsettelse av omfanget av CNS og celle-spesifikk målretting ved administrering av viral vektorer eller nanopartikler i kroppen. Her presenterer vi en protokoll som utnytter den høye gjennomstrømningen og multipleksing evnene til flyt flowcytometri for å tillate en grei kvantifisering av forskjellige celle under typer isolert fra mus hjernen eller ryggmargen, nemlig mikroglia/makrofager, lymfocytter, astrocytter, oligodendrocytes, neurons og endothelial celler. Vi bruker denne tilnærmingen til å fremheve kritiske forskjeller mellom to vev homogenisering metoder i form av celle utbytte, levedyktighet og sammensetning. Dette kan instruere brukeren til å velge den beste metoden avhengig av celletypen (e) av interesse og det bestemte programmet. Denne metoden er ikke egnet for analyse av anatomiske fordelingen, siden vevet er homogenisert til å generere en enkelt celle suspensjon. Men det gjør det mulig å arbeide med levedyktige celler og det kan kombineres med celle-sortering, åpne veien for flere programmer som kan utvide repertoaret av verktøy i hendene på hjerneforsker, alt fra etablering av primær kulturer avledet fra ren celle populasjoner, til gen-uttrykk analyser og biokjemiske eller funksjonelle analyser på veldefinerte celle under typer i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer, ved farmakologisk behandling eller genterapi.
Introduction
Gen-og legemiddel leveranse teknologi (som viral vektorer og nanopartikler) har blitt et kraftig verktøy som kan brukes til å få bedre innsikt i spesifikke molekylære baner som er endret i nevrodegenerative sykdommer og for utvikling av innovative terapeutiske tilnærminger1,2,3. Optimalisering av disse verktøyene er avhengig av kvantifisering av: (1) omfanget av penetrasjon i CNS på ulike administrasjonsveier og (2) målretting av bestemte celle populasjoner. Histologiske analyser brukes vanligvis for å visualisere fluorescerende reporter gener eller fluorescensmerkete nanopartikler i ulike CNS-områder og på tvers av ulike celletyper, identifisert av immunostaining for bestemte celle markører4,5. Selv om denne tilnærmingen gir verdifull informasjon om biodistribusjon av det administrerte genet eller medikament leveringsverktøy, kan teknikken være tidkrevende og arbeidsintensiv, siden den krever: (1) vev fiksering, kryonisk bevaring eller parafin-innebygging og kutting; (2) farging for spesifikke cellulære markører noen ganger krever antigen henting; (3) oppkjøp av fluorescens mikroskopi, som vanligvis tillater analyse av et begrenset antall forskjellige markører i samme eksperiment; (4) bildebehandling for å tillate riktig kvantifisering av signalet av interesse.
Flow flowcytometri har blitt en mye brukt teknikk som utnytter svært spesifikke fluorescerende markører for å tillate ikke bare en rask kvantitativ evaluering av ulike celle fenotyper i celle suspensjoner, basert på uttrykk for overflate eller intracellulære antigener, men også funksjonelle målinger (f. eks, rate av apoptose, spredning, celle syklus analyse, etc.). Fysisk isolering av celler gjennom fluorescerende aktivert celle sortering er også mulig, slik at ytterligere nedstrøms anvendelser (f. eks cellekultur, RNAseq, biokjemiske analyser osv.) 6,7,8.
Tissue homogenisering er et kritisk trinn som er nødvendig for å oppnå en enkelt celle suspensjon for å tillate pålitelig og reproduserbar nedstrøms flyt analytiske evalueringer. Ulike metoder har blitt beskrevet for voksne Brain-tissue homogenisering, hovedsakelig med sikte på å isolere mikroglia celler9,10,11; de kan være samlet klassifisert i to hovedkategorier: (1) mekaniske dissosiasjon, som bruker sliping eller skjærkraft gjennom en Dounce homogenisator (DH) for å rippe hverandre celler fra sine nisjer og danner en relativt homogenisert enkelt celle fjæring, og (2) enzymatisk fordøyelse, som er avhengig av inkubasjons av hakket vev biter på 37 ° c i nærvær av proteolytiske enzymer, slik som Trypsin eller Papain, favoriserer degradering av ekstracellulære matrise for å skape en ganske homogenisert celle suspensjon12.
Uavhengig av hvilken metode som benyttes, er en rensing trinn anbefales etter vev homogenisering å fjerne myelin gjennom sentrifugering på en tetthet gradient eller ved magnetisk valg9,12, før han flyttet til nedstrøms programmer.
Her beskriver vi en vev prosesseringsmetode basert på Papain fordøyelse (PD) etterfulgt av rensing på en tetthet gradient, optimalisert for å få levedyktig heterogen celle suspensjoner fra mus hjernen eller ryggmargen i en tid-følsom måte og egnet for flyt flowcytometri. Videre beskriver vi en 9-farge Flow flowcytometri panel og gating strategien vi vedtatt i laboratoriet for å tillate samtidig diskriminering av forskjellige CNS populasjoner, Live/døde celler eller positivitet for fluorescerende journalister som grønt fluorescerende protein eller rhodamine fargestoff. Ved å anvende denne flyten analytiske analyse, kan vi sammenligne ulike metoder for vevs behandling, dvs., PD versus DH, i form av bevaring av mobilnettet levedyktighet og gir av ulike celletyper.
Detaljene vi gir her kan instruere vedtak om homogenisering protokollen og antistoff kombinasjon til bruk i Flow flowcytometri panel, basert på den spesifikke celletypen (e) av interesse og nedstrøms analyser (f. eks temperaturfølsomme applikasjoner, sporing av spesifikke fluorescerende markører, in vitro-kultur, funksjonelle analyser).
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskriver vi en protokoll for co-rensing og samtidig flyt analytiske analyse av noen av de mest relevante CNS celler fra mus hjernen og ryggmargen. Tradisjonelt har histologiske analyser blitt brukt for å beskrive fordelingen av nanopartikler eller den Transduction effektiviteten til virale vektorer i CNS5,13, eller for å gi innsikt om morfologiske og molekylære endringer som forekommer i bestemte celletyper under en patologi eller ved farmakologisk behan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av Boston Children ‘ s Hospital oppstart midler til A.B., ALSA Grant nr. 17-via-343 til M.P., og kontoret til assisterende forsvarsminister for helsedirektoratet gjennom amyotrofisk lateral sklerose Research program under Award nr. W81XWH-17-1-0036 til M.P. Vi erkjenner DFCI Flow flowcytometri Core for teknisk støtte.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
Referências
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
