Farklı Homojenizasyon Yöntemleri ile Fare Beyin/Omurilikten Alınan Çoklu Hücre Tiplerinin Eşzamanlı Akış Sitometrik Karakterizasyonu
Summary
Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Viral vektör ve nanomalzeme bilimlerinde son gelişmeler araştırmak veya merkezi sinir sistemi (CNS) işlemek için yeni üstün yaklaşımlar için önünü açmıştır. Ancak, bu teknolojilerin daha fazla optimizasyon cns ve vücutta viral vektörler veya nano tanecikleri uygulanması üzerine hücre özel hedefleme ölçüde hızlı ve aerodinamik belirlenmesine olanak sağlayan yöntemleryararlanacaktır. Burada, fare beyin veya omurilikten izole edilen farklı hücre alt tiplerinin, yani mikroglia/makrofajların, lenfositlerin, astrositlerin, oligodendrositlerin, nöronların ve endotel hücrelerinin basit bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamak için akış sitometrisinin yüksek üretim ve çoklama yeteneklerinden yararlanan bir protokol sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisini silyon ile karşılıyoruz. Bu yaklaşımı, hücre verimi, canlılık ve bileşim açısından iki doku homojenizasyon yöntemi arasındaki kritik farklılıkları vurgulamak için uyguluyoruz. Bu, kullanıcıya ilgi çeken hücre türüne ve belirli uygulamaya bağlı olarak en iyi yöntemi seçmesini sağlayabilir. Doku tek hücreli süspansiyon oluşturmak için homojenize olduğundan bu yöntem, anatomik dağılımın analizi için uygun değildir. Ancak, canlı hücrelerle çalışmaya olanak sağlar ve hücre ayrıştırma ile kombine edilebilir, saf hücre popülasyonlarından elde edilen birincil kültürlerin kurulmasından, gen ekspresyonu analizleri ve biyokimyasal veya fonksiyonel analizler nörodejeneratif hastalıklar bağlamında iyi tanımlanmış hücre alt tipleri, üzerine farmakolojik tedavi veya gen tedavisi bağlamında değişen, nörobilimcinin elinde araçların repertuarını genişletebilecek çeşitli uygulamaların önünü açar.
Introduction
Gen ve ilaç dağıtım teknolojileri (viral vektörler ve nano tanecikleri gibi) nörodejeneratif hastalıklarda değiştirilmiş belirli moleküler yollar hakkında daha iyi anlayışlar elde etmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için uygulanabilir güçlü bir araç haline gelmiştir1,2,3. Bu araçların optimizasyonu, aşağıdakilerin nicelleştirilmesine dayanır: (1) CNS’deki penetrasyonun farklı yönetim yolları üzerindeki nüfuz derecesi ve (2) belirli hücre popülasyonlarının hedeflenmesi. Histolojik analizler genellikle floresan muhabir genleri veya floresan etiketli nano tanecikleri farklı CNS alanlarda ve farklı hücre tipleri arasında görselleştirmek için uygulanır, belirli hücre belirteçleri için immünboyama ile tanımlanan4,5. Bu yaklaşım, uygulanan genin veya ilaç dağıtım araçlarının biyodağıtımı hakkında değerli bilgiler sağlasa da, teknik zaman alıcı ve emek açısından yoğun olabilir: (1) doku fiksasyonu, kriyopreservation veya parafin katıştırma ve dilimleme; (2) bazen antijen alımı gerektiren belirli hücresel belirteçler için boyama; (3) floresan mikroskobu ile edinimi, genellikle aynı deney içinde farklı belirteçleri sınırlı sayıda analizi sağlar; (4) görüntü işleme ilgi sinyalinin doğru niceliksel izin vermek.
Akış sitometrisi, hücre süspansiyonlarında farklı hücre fenotiplerinin sadece yüzey veya hücre içi antijenlerin ekspresyonuna dayalı olarak hızlı bir nicel değerlendirmesine değil, aynı zamanda fonksiyonel ölçümlere (örn. apoptoz oranı, çoğalma, hücre döngüsü analizi vb.) olanak sağlamak için çok özel floresan belirteçlerden yararlanan yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelmiştir. Floresan aktif hücre ayrıştırma yoluyla hücrelerin fiziksel izolasyonu da mümkündür, daha fazla aşağı akım uygulamaları (örneğin, hücre kültürü, RNAseq, biyokimyasal analizler vb) izin 6,7,8.
Doku homojenizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir aşağı akım sitometrik değerlendirmeler sağlamak için tek bir hücre süspansiyon elde etmek için gerekli kritik bir adımdır. Farklı yöntemler yetişkin beyin dokusu homojenizasyonu için tarif edilmiştir, özellikle mikroglia hücreleri izole etmek amacıyla9,10,11; genel olarak iki ana kategoride sınıflandırılabilirler: (1) hücreleri nişlerinden ayırmak ve nispeten homojenleştirilmiş tek hücresüspansiyonu oluşturmak için bir Don homogenizer (DH) ile taşlama veya kesme kuvveti kullanan mekanik ayrışma, ve (2) enzimositsel sindirim, hangi 37 °C’de kin doku parçalarının kuluçka dayanır proteolitik enzimlerin varlığında, tripsin veya papain gibi, oldukça homojenleştirilmiş hücre süspansiyon oluşturmak için ekstrasellüler matris bozulması lehine12.
Hangi yöntemden ne olursa olsun, doku homojenizasyonundan sonra bir yoğunluk gradyan üzerinde santrifüj yoluyla miyelin ilerlediği veya manyetik seçimle 9,12, aşağı akım uygulamalarına geçmeden önce bir arınma adımı önerilir.
Burada, papain sindirimine dayalı bir doku işleme yöntemini (PH) ve ardından, fare beyninden veya omurilikten zamana duyarlı ve akış sitometrisine uygun olarak uygulanabilir heterojen hücre süspansiyonları elde etmek için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan üzerinde saflaştırmayı tanımlıyoruz. Ayrıca, 9 renkli akış sitometri paneli ve farklı CNS popülasyonları, canlı / ölü hücreler veya pozitiflik floresan muhabirler için yeşil floresan protein veya rhodamine boya gibi eşzamanlı ayrımcılık sağlamak için laboratuvarda kabul edilen gating stratejisi açıklar. Bu akış sitometrik analizini uygulayarak, hücresel canlılığın korunması ve farklı hücre tiplerinin verimleri açısından doku işleme yöntemlerini, yani PH ile DH’yi karşılaştırabiliriz.
Burada sağladığımız ayrıntılar, homojenizasyon protokolü ve akış sitometri panelinde kullanılacak antikor kombinasyonu hakkında, belirli hücre tipi(ler) ve akış analizlerine (örn. ısıya duyarlı) dayanarak karar verebilir. uygulamalar, spesifik floresan belirteçlerin takibi, in vitro kültür, fonksiyonel analizler).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada fare beyni ve omurilikten en alakalı CNS hücrelerinin eş saflaştırma ve eşzamanlı akış sitometrik analizi için bir protokol açıklıyoruz. Geleneksel olarak, histolojik analizler nano tanecikleri dağılımı veya CNS viral vektörlerin transdüksiyon verimliliği tanımlamak için uygulanmıştır5,13, veya bir patoloji sırasında veya farmakolojik tedavi üzerine belirli hücre tiplerinde meydana gelen morfolojik ve moleküler değişiklikler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Boston Çocuk Hastanesi start-up fonları a.b., ALSA hibe nr tarafından finanse edilmiştir. 17-IIP-343 M.P., ve Ödül No altında Aminotrofik Lateral Skleroz Araştırma Programı ile Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi. W81XWH-17-1-0036’dan M.P.’ye. Teknik destek için DFCI Flow Cytometry Core’u kabul ediyoruz.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
Referências
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
