Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen
Summary
Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.
Abstract
Organotypic slice Culture is een krachtig in-vitro model dat in vivo condities nauwer bootst dan dissociatie van primaire celculturen. In de vroege postnatale ontwikkeling, cerebellaire Purkinje cellen zijn bekend om te gaan door middel van een kwetsbare periode, waarin ze ondergaan geprogrammeerde celdood. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van de organotypische cerebellaire segment cultuur van de muis tijdens deze kritieke tijd. De plakjes zijn verder gelabeld om de overleving van de Purkinje-cel en de werkzaamheid van neuroprotectieve behandelingen te beoordelen. Deze methode kan zeer waardevol zijn voor het scherm voor nieuwe neuroactieve moleculen.
Introduction
In vitro Modeling is een essentieel instrument in biomedisch onderzoek. Het stelt onderzoekers in staat om specifieke mechanismen in beperkte celtypen te bestuderen en nauw te beheersen, of in geïsoleerde systemen/organen. Organotypic slice Culture is een veel gebruikte in vitro techniek, vooral op het gebied van neurowetenschappen1. De methode werd voor het eerst vastgesteld door Gähwiler, die hersenen plakjes met behulp van de roller Tube techniek2, en later gewijzigd door Yamamoto et al., die introduceerde het gebruik van een microporeus membraan voor het uitvoeren van corticale segment culturen3. In vergelijking met primaire celculturen presenteren organotypische segment culturen het voordeel van het behoud van de cytoarchitectuur van het weefsel, evenals inheemse celcelverbindingen in het vlak van de weefsel sectie.
Organotypic plakjes zijn gekweekt uit vele delen van het centrale zenuwstelsel, zoals de Hippocampus4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7, en ruggenmerg8,9, onder anderen. Ze zijn bewezen een krachtig instrument in de Drug Discovery studies10. De effecten van neuroactieve moleculen kunnen op vele manieren worden beoordeeld: overleving en neurodegeneratie met behulp van immunokleuring en biochemie testen, neuronale circuit vorming, of verstoring met behulp van elektrofysiologie en live-beeldvorming.
Het doel van dit werk is om een eenvoudige methode te beschrijven om organotypische cerebellaire segment cultuur uit te voeren, waarvan bekend is dat het een relevant model is om de Cerebellaire ontwikkeling in vitro na te bootsen. In het bijzonder richtten we ons op de studie van de Purkinje Cell-ontwikkelings dood. In vivo ondergaan de Purkinje-cellen apoptosis tijdens de eerste postnatale week, met een piek op postnatale dag 3 (P3)11. Hetzelfde patroon wordt waargenomen in cerebellaire segment cultuur, met Purkinje neuronen sterven door apoptosis wanneer cerebella worden genomen van dieren tussen P1 en P8, met een piek op P34,12. Het gebruik van de organotypische cerebellaire segment culturen heeft het toegestaan verschillende neuroprotectieve moleculen7,13te identificeren en een deel van de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij deze geprogrammeerde celdood14,15,16. Hier beschrijven we een protocol op basis van de studie van Stoppini et al.17 in Hippocampus, en aangepast aan cerebellum door Dusart et al.4 het omvat snelle dissectie en hakken van postnatale cerebella; snijden cultuur op een celkweek invoegen met een microporeus membraan, met of zonder neuroprotectieve behandeling; en immunofluorescentie kleuring om neuronale overleving te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebellaire segment cultuur is een krachtig hulpmiddel om geprogrammeerde Purkinje celdood te bestuderen tijdens de postnatale ontwikkeling. Deze techniek kan worden gebruikt om snel kandidaatmoleculen voor hun neuroprotectieve potentieel te scherm. Het belangrijkste voordeel is dat de installatie eenvoudig en zeer kosteneffectief is, en alleen een bescheiden investering in apparatuur vereist (een vibratome kan tot 3 keer meer kosten dan een weefsel Chopper). Bovendien kunnen 10 tot 15 gezonde schijfjes worden gegeneree…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaging work werd uitgevoerd in het Northwestern University Center voor geavanceerde microscopie royaal ondersteund door NCI CCSG P30 CA060553 toegekend aan het Robert H Lurie uitgebreide Kankercentrum. We danken Sean McDermott voor zijn technische assistentie en ondersteuning, en Maya Epstein voor de hand getekende illustraties getoond in Figuur 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
Referências
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neurociência. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neurociência. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
