Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures
Summary
Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.
Abstract
La coltura delle fette organotipiche è un potente modello in vitro che imita le condizioni in vivo più da vicino rispetto alle colture cellulari primarie dissociate. Nello sviluppo postnatale, le cellule cerebellari Purkinje sono note per passare attraverso un periodo vulnerabile, durante il quale subiscono la morte cellulare programmata. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire la coltura della fetta di cerebellar organotypic del topo durante questo momento critico. Le fette sono ulteriormente etichettate per valutare la sopravvivenza delle cellule Purkinje e l’efficacia dei trattamenti neuroprotettivi. Questo metodo può essere estremamente prezioso per lo screening per nuove molecole neuroattive.
Introduction
La modellazione in vitro è uno strumento essenziale nella ricerca biomedica. Consente agli sperimentatori di studiare e controllare strettamente meccanismi specifici in tipi di cellule limitate o in sistemi/organi isolati. La coltura delle fette organotipiche è una tecnica in vitro ampiamente utilizzata, specialmente nel campo delle neuroscienze1. Il metodo è stato inizialmente stabilito da Gàhwiler, che coltiva fette di cervello utilizzando la tecnica del tubo a rulli2e successivamente modificato da Yamamoto et al., che ha introdotto l’uso di una membrana microporosa per eseguire colture di fette corticali3. Rispetto alle colture cellulari primarie, le colture di fette organotipiche presentano il vantaggio di preservare la citoarchitettura del tessuto, così come le connessioni cellulari native nel piano della sezione dei tessuti.
Le fette organotipiche sono state coltivate da molte parti del sistema nervoso centrale, come l’ippocampo4, la corteccia5, lo striato6, il cervelletto4,7e il midollo spinale8,9, tra gli altri. Essi hanno dimostrato di essere un potente strumento negli studi di scoperta di farmaci10. Gli effetti delle molecole neuroattive possono essere valutati in molti modi: sopravvivenza e neurodegenerazione utilizzando analisi immunostaining e biochimiche, formazione di circuiti neuronali o interruzione mediante elettrofisiologia e live-imaging.
L’obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere un metodo semplice per eseguire la coltura della sezione cerebellar organotipica, che è noto per essere un modello rilevante per imitare lo sviluppo cerebellar in vitro. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio della morte per lo sviluppo cellulare di Purkinje. In vivo, le cellule Purkinje subiscono l’apoptosi durante la prima settimana postnatale, con un picco al giorno postnatale 3 (P3)11. Lo stesso modello si osserva nella coltura della fetta cerebellare, con i neuroni Purkinje che muoiono per apoptosi quando la cerebella viene prelevata da animali tra P1 e P8, con un picco al P34,12. L’uso delle colture di fette di cerebellare organotipiche ha permesso di identificare diverse molecole neuroprotettive7,13, oltre a comprendere parte dei meccanismi coinvolti in questa morte cellulare programmata14,15,16. Qui, descriviamo un protocollo basato sullo studio di Stoppini et al.17 in ippocampo, e adattato al cerrebelum da Dusart et al.4 Include una rapida dissezione e taglio della cerebella postnatale; affettare la coltura su un inserto di coltura cellulare contenente una membrana microporosa, con o senza trattamento neuroprotettivo; e l’immunofluorescenza per valutare la sopravvivenza neuronale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La coltura della fetta Cerebellar è un potente strumento per studiare la morte programmata delle cellule Purkinje durante lo sviluppo postnatale. Questa tecnica può essere utilizzata per vagliare rapidamente le molecole candidate per il loro potenziale neuroprotettivo. Il vantaggio principale è che l’impostazione è semplice e molto conveniente, e richiede solo un modesto investimento in attrezzature (un vibratome può costare fino a 3 volte più di un elicottero di tessuto). Inoltre, da 10 a 15 fette sane possono ess…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro di imaging è stato eseguito presso il Northwestern University Center for Advanced Microscopy generosamente supportato da NCI CCSG P30 CA060553 assegnato al Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo Sean McDermott per l’assistenza tecnica e il supporto e Maya Epstein per le illustrazioni disegnate a mano illustrate nella Figura 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
Referências
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