오르가노티픽 소뇌 슬라이스 배양에서 푸르킨제 세포 생존
Summary
Organotypic 슬라이스 문화는 신경 발달 또는 퇴행성 / 재생 과정을 연구할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서, 우리는 마우스 소뇌 슬라이스 배양에서 Purkinje 세포의 신경 발달 죽음을 모델로 하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 신경 보호 약물 발견에 대 한 연구 혜택을 받을 수 있습니다.
Abstract
Organotypic 슬라이스 배양은 분리된 1차 세포 배양보다 생체 내 상태를 더 가깝게 모방하는 강력한 시험관 내 모델입니다. 초기 출생 후 발달에서, 소뇌 Purkinje 세포는 그(것)들이 프로그램한 세포 죽음을 겪는 동안 취약한 기간을 통과하는 것을 알려지고 있습니다. 여기서, 우리는 이 중요한 시간 동안 마우스 organotnotypic 소뇌 슬라이스 배양을 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 슬라이스는 Purkinje 세포 생존및 신경 보호 처리의 효험을 평가하기 위하여 추가 표지됩니다. 이 방법은 새로운 신경 활성 분자를 선별하는 데 매우 유용 할 수 있습니다.
Introduction
생체 외 모델링은 생물 의학 연구에 필수적인 도구입니다. 그것은 조사자가 공부하고 제한한 세포 모형에 있는 특정 기계장치를 단단히 통제할 수 있습니다, 또는 고립된 시스템/기관에서. 오르가노티픽 슬라이스 배양은 특히 신경과학 분야에서 시험관내 기술로 널리 사용되고있다 1. 이 방법은 먼저 롤러 튜브 기술2를사용하여 뇌 조각을 배양한 Gähwiler에 의해 처음 확립되었으며, 나중에 야마모토 등에서 수정되었으며, 이들은 피질 슬라이스 배양을 수행하기 위해 미세 다공성 멤브레인의 사용을도입했습니다 3. 1 차적인 세포 배양에 비해, organotypic 슬라이스 배양은 조직의 세포 아키텍처를 보존하는 이점을 제시, 조직 섹션의 평면에서 뿐만 아니라 네이티브 세포 세포 연결.
Organotypic 조각은 해마4,피질5,줄무늬6,소뇌4,7,척수8,9,다른 사람의 사이에서 와 같은 중추 신경계의 많은 부분에서 배양되었습니다. 그들은 약물 발견 연구에서 강력한 도구로 입증되었습니다10. 신경 활성 분자의 효과 여러 가지 방법으로 평가 될 수 있다: 면역 염색 및 생화학 분석, 신경 회로 형성, 또는 전기 생리학 및 라이브 이미징을 사용 하 여 중단을 사용 하 여 생존 및 신경 변성.
이 작업의 목적은 시험관에서 소뇌 발달을 모방하는 관련 모델로 알려져 있는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화를 수행하는 간단한 방법을 설명하는 것입니다. 특히, 우리는 Purkinje 세포 발달 죽음의 연구 결과에 집중했습니다. 생체 내에서, Purkinje 세포는 출생 후 첫 번째 주 동안 세포 자멸을 겪고, 출생 후 일 3 (P3)11에피크. 소뇌 슬라이스 배양에서 동일한 패턴이 관찰되며, 세레베야가 P1과 P8 사이의 동물로부터 채취될 때, P34,12에서피크를 가진 후발성 세포사멸에 의해 죽어가는 Purkinje 뉴런과 함께 관찰된다. organotypic 소뇌 슬라이스 배양의 사용은 여러 신경 보호분자를식별 할 수 있다7,13,뿐만 아니라 이 프로그램 된 세포 사멸에 관련된 메커니즘의 일부를 이해14,15,16. 여기서, 우리는 해마에서 Stoppini et al.17의 연구에 기초한 프로토콜을 설명하고, Dusart et al.4에 의해 소뇌에 적응하여 산후 뇌의 급속한 해부 및 절단을 포함한다; 미세다공막을 함유하는 세포 배양 삽입체상에 배양물을 슬라이스하는 경우, 신경보호 치료 유무에 관계없이; 및 면역 형광 염색신경 생존을 평가하기 위해.
Protocol
Representative Results
Discussion
소뇌 슬라이스 배양은 산후 발달 중에 프로그램된 Purkinje 세포 사멸을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 그들의 신경 보호 잠재력을 위한 후보 분자를 급속하게 스크리는 것을 이용될 수 있습니다. 주요 장점은 설정이 간단하고 매우 비용 효율적이며, 단지 장비에 적당한 투자가 필요하다는 것입니다 (진동은 조직 헬기보다 최대 3 배 더 많은 비용이 들 수 있습니다). 또한, 10 ~15개의 건강한 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
화상 진찰 일은 로버트 H 루리 포괄적인 암 센터에 수여된 NCI CCSG P30 CA060553에 의해 관대하게 지원되는 고급 현미경 검사법에 대한 노스웨스턴 대학 센터에서 행해졌습니다. 숀 맥더모트의 기술 지원과 지원에 감사드리며, 그림 1에나타난 손으로 그린 그림에 대해 마야 엡스타인에게 감사드립니다.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
Referências
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