Purkinje Cell выживания в органотипической церебеллярной части культур
Summary
Органотипические срезные культуры являются мощным инструментом для изучения нейроразвития или дегенеративных / регенеративных процессов. Здесь мы описываем протокол, который моделирует нейроразвитие смерти клеток Purkinje в мыши мозжечковой культуры ломтик. Этот метод может принести пользу исследованиям в нейропротекторных открытий наркотиков.
Abstract
Organotypic срез культуры является мощным in vitro модель, которая имитирует в условиях vivo более тесно, чем разъединенных первичных культур клеток. В начале послеродового развития, мозжечковые клетки Purkinje, как известно, проходят через уязвимый период, в течение которого они претерпевают запрограммированную гибель клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выполнения мыши organotypic мозжечковой культуры ломтик в это критическое время. Ломтики дополнительно помечены для оценки выживания клеток Пуркинье и эффективности нейропротекторных методов лечения. Этот метод может быть чрезвычайно ценным для проверки новых нейроактивных молекул.
Introduction
Моделирование in vitro является важным инструментом в биомедицинских исследованиях. Это позволяет следователям изучать и жестко контролировать конкретные механизмы в ограниченных типов клеток, или в изолированных системах / органах. Органотипическая срезная культура широко используется в пробирке техника, особенно в области неврологии1. Метод был впервые создан Гюхвилер, который культивируется мозг ломтиками с помощью роликовой трубки техники2, а затем изменены Ямамото и др., который ввел использование микропористых мембраны для выполнения корковых культур ломтик3. По сравнению с первичными культурами клеток, органотипические срезные культуры представляют собой преимущество сохранения цитоархитектуры ткани, а также родных клеточных соединений в плоскости ткани.
Органотипические ломтики были культивированы из многих частей центральной нервной системы, таких как гиппокамп4,кора5,стриатум6,мозжечок4,7,и спинной мозг 8,9, среди других. Они были доказаны, чтобы быть мощным инструментом в исследованиях открытия наркотиков10. Эффекты нейроактивных молекул можно оценить по-разному: выживание и нейродегенерация с помощью иммуностоинга и биохимии анализов, формирования нейрональных цепей, или нарушения с помощью электрофизиологии и живой визуализации.
Цель этой работы состоит в том, чтобы описать простой метод для выполнения органотипической мозжечковой культуры ломтик, который, как известно, соответствующая модель для имитации мозжечкового развития в пробирке. В частности, мы сосредоточились на изучении смерти клеток Пуркинье. In vivo, Purkinje клетки проходят апоптоз в течение первой послеродовой недели, достигнув пика в послеродовой день 3 (P3)11. Такая же картина наблюдается в мозжечковой культуры ломтик, с Purkinje нейронов умирают от апоптоза, когда церебелла взяты из животных между P1 и P8, с пиком на P34,12. Использование органотипических мозжечковых культур ломтик позволило определить несколько нейропротекторных молекул7,13, а также понимание части механизмов, участвующих в этой запрограммированной клеточной смерти14,15,16. Здесь мы описываем протокол, основанный на изучении Stoppini et al.17 в гиппокампе, и адаптированный к мозжечке Dusart et al.4 Он включает в себя быстрое вскрытие и измельчение послеродовой церебелли; нарезка культуры на вставку клеточной культуры, содержащая микропористую мембрану, с нейропротекторным лечением или без нее; и иммунофлуоресценции окрашивания для оценки выживаемости нейронов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Церебелля среза культура является мощным инструментом для изучения запрограммированных Purkinje смерти клеток во время послеродового развития. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекулы кандидатов на их нейропротекторный потенциал. Основным преимуществом является ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaging работы были выполнены в Северо-Западном университете Центр расширенной микроскопии щедро поддерживается NCI CCSG P30 CA060553 присуждается Роберт H Lurie Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим Шона Макдермотта за его техническую помощь и поддержку, а Майю Эпштейн за рисованные иллюстрации, показанные на рисунке 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
Referências
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neurociência. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neurociência. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
