Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Summary

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Abstract

Las micobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la tuberculosis humana, liberan naturalmente vesículas extracelulares (EV) que contienen moléculas inmunológicamente activas. El conocimiento sobre los mecanismos moleculares de la biogénesis vesícula, el contenido de las vesículas y sus funciones en la interfaz patógeno-huésped es muy limitado. Abordar estas preguntas requiere procedimientos rigurosos para el aislamiento, purificación y validación de vehículos eléctricos. Anteriormente, se encontró que la producción de vesículas se mejoró cuando M. tuberculosis estaba expuesta a una restricción de hierro, una condición encontrada por Mtb en el entorno huésped. Aquí se presenta un protocolo completo y detallado para aislar y purificar los vehículos eléctricos de las micobacterias con deficiencia de hierro. Se aplican métodos cuantitativos y cualitativos para validar los vehículos eléctricos purificados.

Introduction

Las vesículas extracelulares micobacterianas (MEV) son nanopartículas unidas a la membrana, de 60 a 300 nm de tamaño, liberadas naturalmente por micobacterias de crecimiento rápido y lento¹. Los MEV liberados por micobacterias patógenas constituyen un mecanismo para interactuar con el huésped a través de proteínas inmunológicamente activas, lípidos y glucólidos secretados de manera concentrada y protegida^2,3,4. Para caracterizar MEVs y comprender su biogénesis y funciones, son cruciales métodos estrictos y eficientes de purificación y validación de vesículas. Hasta ahora, los MEV se han aislado de los filtrados de cultivo de micobacterias cultivadas en un medio rico en hierro^1,5,6,7,8.

Sin embargo, trabajos anteriores demostraron que la limitación del hierro estimula en gran medida la liberación de vesículas en Mtb, posiblemente para capturar hierro a través de mycobactin, un siderophore secretado en MEVs⁹. Aunque se han descrito procedimientos para el aislamiento de MEV de Mtb cultivadoen en medios de hierro alto, no se ha informado de una metodología eficiente para obtener MEV de cultivos de hierro bajos. Por lo tanto, el objetivo de este método es aislar, purificar y cuantificar los MEV obtenidos de cultivos de hierro bajos para que puedan ser utilizados para ensayos bioquímicos y funcionales y para el análisis de determinantes genéticos de la producción de vesículas en micobacterias.

Protocol

1. Preparación del medio definido agotado de hierro Preparar 1 L de medio mínimo (MM) disolviendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagina, 20 ml de glicerol, y 2 g de dextrosa en 900 ml de agua desionizada en un recipiente de plástico. Evite el vidrio para evitar la contaminación del hierro. Ajuste el pH a 6,8 con 5 NaOH y el volumen a 1 L con agua. Añadir 50 g de resina quelante metálica (MCR) y agitar suavemente con una barra de agitación magnética durante 24 h a 4oC. Esteri…

Representative Results

Los MEV fueron purificados por sedimentación diferencial en un gradiente de densidad(Figura 1, Figura 2). En las condiciones descritas, los MEV se separaron principalmente en la fracción de gradiente 3 (F3), que corresponde al 25% de iodixanol. Esta conclusión se basa en la detección de proteínas, lípidos de membrana, visualización microscópica de MEV intactos, distribución del tamaño de nanopartículas y reactividad po…

Discussion

Múltiples métodos para purificar exosomas derivados de células eucariotas se han desarrollado¹². Por el contrario, hay información limitada sobre métodos eficaces para purificar los vehículos eléctricos derivados de bacterias⁷. El aislamiento eficiente de los vehículos eléctricos derivados de Mtb debe tener en cuenta las dificultades intrínsecas en el crecimiento de esta micobacterium patógena. Mtb tiene un largo tiempo de división (24 h) y debe manejarse en con…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit