Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden

Summary

Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.

Abstract

Mykobakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, setzen natürlich extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die immunologisch aktive Moleküle enthalten. Das Wissen über die molekularen Mechanismen der Vesikelbiogenese, den Gehalt der Vesikel und ihre Funktionen an der Pathogen-Host-Schnittstelle ist sehr begrenzt. Um diese Fragen zu lösen, sind strenge Verfahren für die Isolierung, Reinigung und Validierung von Elektrofahrzeugen erforderlich. Zuvor wurde festgestellt, dass die Vesikelproduktion verbessert wurde, wenn M. tuberculosis einer Eisenbeschränkung ausgesetzt war, ein Zustand, dem Mtb in der Wirtsumgebung begegnete. Hier wird ein vollständiges und detailliertes Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Elektrofahrzeugen von eisenmangeligen Mykobakterien vorgestellt. Quantitative und qualitative Methoden werden angewendet, um gereinigte Elektrofahrzeuge zu validieren.

Introduction

Mykobakterielle extrazelluläre Vesikel (MEVs) sind membrangebundene Nanopartikel mit einer Größe von 60 bis 300 nm, die natürlicherweise von schnell- und langsam wachsenden Mykobakterien freigesetzt werden¹. MEVs, die von pathogenen Mykobakterien freigesetzt werden, bilden einen Mechanismus, um mit dem Wirt über immunologisch aktive Proteine, Lipide und Glykolipide zu interagieren, die konzentriert und geschützt abgesondert werden^2,3,4. Um MEVs zu charakterisieren und ihre Biogenese und Funktionen zu verstehen, sind strenge und effiziente Methoden der Vesikelreinigung und -validierung von entscheidender Bedeutung. Bisher wurden MEVs aus den Kulturfiltraten von Mykobakterien isoliert, die in einem eisenreichen^Medium1^,5,6,7,8angebaut wurden.

Frühere Arbeiten zeigten jedoch, dass die Eisenbegrenzung die Freisetzung von Vesikel in Mtb stark stimuliert, möglicherweise um Eisen über Mycobactin zu fangen, ein Siderophor, das in MEVs⁹abgesondert wird. Obwohl Verfahren für die Isolierung von MEVs von Mtb, die in eisenhohem Medium kultiviert wurden, beschrieben wurden, wurde keine effiziente Methode zur Gewinnung von MEVs aus eisenarmen Kulturen beschrieben. Daher ist das Ziel dieser Methode, MEVs aus niedrigen Eisenkulturen zu isolieren, zu reinigen und zu quantifizieren, so dass sie für biochemische und funktionelle Tests und für die Analyse genetischer Determinanten der Vesikelproduktion in Mykobakterien verwendet werden können.

Protocol

1. Vorbereitung des eisenabschöpfungsorientierten definierten Mediums Bereiten Sie 1 l minimalen Medium (MM) durch Auflösen von 5 g KH2PO4, 5 g L-Asparagin, 20 ml Glycerin und 2 g Dextrose in 900 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter vor. Vermeiden Sie Glas, um Eisenkontamination zu verhindern. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 N NaOH und das Volumen auf 1 L mit Wasser ein. 50 g Metallchelatharz (MCR) hinzufügen und vorsichtig mit einem magnetischen Rührst…

Representative Results

MEVs wurden durch Differentialsedimentation in einem Dichtegradienten gereinigt (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter den beschriebenen Bedingungen trennten sich DIE MEVs meist in Gradientenfraktion 3 (F3), was 25% Iodixanol entspricht. Diese Schlussfolgerung basiert auf dem Nachweis von Protein, Membranlipid, mikroskopischer Visualisierung intakter MEVs, Nanopartikelgrößenverteilung und positiver Reaktivität mit einem Antivesicle…

Discussion

Mehrere Methoden zur Reinigung von eukaryotischen Zell-abgeleiteten Exosomen wurden entwickelt¹². Im Gegensatz dazu gibt es nur begrenzte Informationen über wirksame Methoden zur Reinigung von bakteriellen EVs⁷. Effiziente Isolierung von Mtb-abgeleiteten Elektrofahrzeugen muss die intrinsischen Schwierigkeiten beim Anbau dieses pathogenen Mycobacteriums berücksichtigen. Mtb hat eine lange Teilungszeit (24 h) und sollte unter Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) Bedingungen be…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit