Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Summary

Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.

Abstract

I micobatteri, tra cui Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agente causale della tubercolosi umana, rilasciano naturalmente vescicoli extracellulari (EV) contenenti molecole immunologicamente attive. La conoscenza dei meccanismi molecolari della biogenesi vescicante, del contenuto delle vescibole e delle loro funzioni nell’interfaccia patogeno-ospite è molto limitata. Per affrontare queste questioni sono necessarie procedure rigorose per l’isolamento, la purificazione e la convalida dei veicoli elettrici. In precedenza, la produzione di vescicola era migliorata quando M. tuberculosis era esposto a restrizione del ferro, una condizione riscontrata da Mtb nell’ambiente host. Presentato qui è un protocollo completo e dettagliato per isolare e purificare i veicoli elettrici dai micobatteri carenti di ferro. I metodi quantitativi e qualitativi vengono applicati per convalidare i VE purificati.

Introduction

Le vescicole extracellulari micobatteriche (MEV) sono nanoparticelle legate alla membrana, di dimensioni di 60-300 nm, naturalmente rilasciate da micobatteri a crescita rapida e lenta¹. I MEV rilasciati dai micobatteri patogeni costituiscono un meccanismo per interagire con l’ospite tramite proteine immunologicamente attive, lipidi e glicolipidi secreti in modo concentrato e protetto^2,3,4. Per caratterizzare i MEV e comprenderne la biogenesi e le funzioni, sono cruciali metodi rigorosi ed efficienti di purificazione e convalida delle vesciche. Finora, i MEV sono stati isolati dalla coltura filtrati di micobatteri coltivati in un mezzo ricco di ferro^1,5,6,7,8.

Tuttavia, il lavoro precedente ha dimostrato che la limitazione del ferro stimola notevolmente il rilascio di vesciche in Mtb,possibilmente per catturare il ferro tramite mycobactin, un siderophore secreto in MEV⁹. Sebbene siano state descritte le procedure per l’isolamento dei MEV dai Mtb coltivati nell’alto mezzo di ferro, non è stata riportata una metodologia efficiente per ottenere MEV da culture di ferro basso. Pertanto, l’obiettivo di questo metodo è quello di isolare, purificare e quantificare i MEV ottenuti da colture di ferro basse in modo che possano essere utilizzati per saggi biochimici e funzionali e per l’analisi dei determinanti genetici della produzione di vescicoli nei micobatteri.

Protocol

1. Preparazione del mezzo definito impoverito di ferro Preparare 1 L di mezzo minimo (MM) sciogliendo 5 g di KH2PO4, 5 g di L-asparagine, 20 mL di glicerolo e 2 g di dextrose in 900 mL di acqua deionizzata in un contenitore di plastica. Evitare il vetro per evitare la contaminazione da ferro. Regolare il pH a 6,8 con 5 N NaOH e il volume a 1 L con acqua. Aggiungere 50 g di resina metallica chelante (MCR) e agitare delicatamente con una barra di stirazione magnetica per 24 h a 4 g…

Representative Results

I MEV sono stati purificati dalla sedimentazione differenziale in un gradiente di densità (Figura 1, Figura 2). Nelle condizioni descritte, MEV separati per lo più nella frazione sfumata 3 (F3), che corrisponde al 25% di iodixanol. Questa conclusione si basa sul rilevamento di proteine, lipidi della membrana, visualizzazione microscopica di MEV intatti, distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle e reattività positiva …

Discussion

Sono stati sviluppati diversi metodi per purificare gli esosomi eucarioti derivati dalle cellule¹². Al contrario, vi sono informazioni limitate sui metodi efficaci per purificare gli EV⁷derivati dai batteri. L’isolamento efficiente dei veicoli elettrici derivati da Mtb deve considerare le difficoltà intrinseche nella coltivazione di questo micatacterio patogeno. Mtb ha un lungo tempo di divisione (24 h) e deve essere gestito in condizioni di biosicurezza di livello tre (BS…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit