Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Summary

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Abstract

Micobactérias, incluindo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose humana, liberam naturalmente vesículas extracelulares (EVs) contendo moléculas imunologicamente ativas. O conhecimento sobre os mecanismos moleculares da biogênese vesícula, o conteúdo das vesículas e suas funções na interface patógeno-hospedeiro é muito limitado. Abordar essas questões requer procedimentos rigorosos para isolamento, purificação e validação de EVs. Previamente, a produção do vesicle foi encontrada para ser realçada quando a tuberculose de M. foi expor à limitação do ferro, uma circunstância encontrada por Mtb no ambiente do anfitrião. Apresentado aqui é um protocolo completo e detalhado para isolar e purificar EVs de micobactérias deficientes em ferro. Métodos quantitativos e qualitativos são aplicados para validar EVs purificados.

Introduction

As vesículas extracelulares micobacterianas (MEVs) são nanopartículas ligadas à membrana, de 60 a 300 nm de tamanho, naturalmente liberadas por micobactérias de crescimento rápido e lento^1. Mevs liberados por micobactérias patogênicas constituem um mecanismo para interagir com o hospedeiro através de proteínas imunologicamente ativas, lipídios e glicolipides secretados de forma concentrada e protegida^2,3,4. Para caracterizar MEVs e compreender a sua biogênese e funções, métodos rigorosos e eficientes de purificação e validação de vesículas são cruciais. Até agora, mevs foram isolados da cultura filtrates de micobactérias cultivadas em um meio rico em ferro^1,5,6,7,8.

No entanto, trabalhos anteriores demonstraram que a limitação de ferro estimula muito a liberação de vesículas em Mtb, possivelmente para capturar ferro via micobactina, um sideróforo secretado em MEVs⁹. Embora os procedimentos para o isolamento de MEVs de Mtb cultivados em médio de alto ferro tenham sido descritos, uma metodologia eficiente para obter MEVs de culturas de baixo ferro não foi relatada. Portanto, o objetivo deste método é isolar, purificar e quantificar os MEVs obtidos de culturas de baixo ferro para que possam ser usados para ensaios bioquímicos e funcionais e para a análise de determinantes genéticos da produção de vesículas em micobactérias.

Protocol

1. Preparação do meio definido empobrecido em ferro Prepare 1 L de médio mínimo (MM) dissolvendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 mL de glicerol e 2 g de dextrose em 900 mL de água desionizada em um recipiente de plástico. Evite o vidro para evitar a contaminação por ferro. Ajuste o pH para 6,8 com 5 N NaOH e o volume para 1 L com água. Adicione 50 g de resina quelante de metal (MCR) e agita-se suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 h a 4 °C. …

Representative Results

Os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade (Figura 1, Figura 2). Nas condições descritas, os MEVs se separaram principalmente na fração de gradiente 3 (F3), o que corresponde a 25% de iodixanol. Esta conclusão baseia-se na detecção de proteínas, lipídios de membrana, visualização microscópica de MEVs intactos, distribuição de tamanho de nanopartículas e reatividade positiv…

Discussion

Vários métodos para purificar exossomos derivados de células eucarióticas foram desenvolvidos^12. Em contraste, há informações limitadas sobre métodos eficazes para purificar EVs derivados de bactérias⁷. O isolamento eficiente dos EVs derivados de Mtb precisa considerar as dificuldades intrínsecas no crescimento dessa micobactéria patogênica. Mtb tem um longo tempo de divisão (~ 24 h) e deve ser tratado em condições de nível de biossegurança três (BSL-3). P…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit