Isolering och karaktärisering av extracellulära blåsor som produceras av Järnbegränsade mykobakterier
Summary
Mycobacterium tuberculosis visar ökad produktion och frisättning av extracellulära blåsor som svar på låga järn förhållanden. Detta arbete specificerar ett protokoll för att generera låga järn förhållanden och metoder för rening och karakterisering av mycobakteriell extracellulära blåsor som släppts som svar på järnbrist.
Abstract
Mykobakterier, inklusive Mycobacterium tuberculosis (MTB), smittämnen av mänsklig tuberkulos, naturligt frisättning extracellulära blåsor (EVS) som innehåller immunologiskt aktiva molekyler. Kunskap om de molekylära mekanismerna hos vesikler biogenes, innehållet i vesiklarna, och deras funktioner vid pathogen-Host-gränssnittet är mycket begränsad. Att ta itu med dessa frågor kräver rigorösa procedurer för isolering, rening och validering av EVs. Tidigare konstaterades att vesikelproduktionen förstärktes när M. tuberkulos utsattes för järn restriktion, ett tillstånd som MTB stötte på i värdmiljön. Presenteras här är ett komplett och detaljerat protokoll för att isolera och rena EVs från järn-bristfällig mykobakterier. Kvantitativa och kvalitativa metoder tillämpas för att validera renade EVs.
Introduction
Mykobakteriella extracellulära blåsor (MEVS) är membran-bundna nanopartiklar, 60 − 300 nm i storlek, naturligt frigörs genom snabb-och långsamt växande mykobakterier1. MEVS släpptes av patogena mykobakterier utgör en mekanism för att interagera med värden via immunologiskt aktiva proteiner, lipider, och glykolipider utsöndras i ett koncentrerat och skyddat sätt2,3,4. För att karakterisera MEVs och förstå deras biogenes och funktioner är strikta och effektiva metoder för vesikelrening och validering avgörande. Hittills har MEVS isolerats från kulturfiltrat av mykobakterier som odlas i ett järnrikt medium1,5,6,7,8.
Men tidigare arbete visat att järn begränsning kraftigt stimulerar vesikler release i MTB, möjligen för att fånga järn via mycobactin, en siderophore utsöndras i MEVs9. Även om förfaranden för MEVs isolering från MTB odlade i hög järn medium har beskrivits, en effektiv metod för att få MEVs från låga järn kulturer har inte rapporterats. Därför är målet med denna metod att isolera, rena och kvantifiera MEVs erhålls från låga järn kulturer så att de kan användas för biokemiska och funktionella analyser och för analys av genetiska bestämningsfaktorer för vesikelproduktion i mykobakterier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera metoder för att rena eukaryota cell-härledda exosomer har utvecklats12. Däremot finns det begränsad information om effektiva metoder för att rena bakterier som härrör EVs7. Effektiv isolering av MTB-derived EVs måste beakta de inneboende svårigheterna att odla denna patogena Mycobacterium. MTB har en lång Division tid (~ 24 h) och bör hanteras i biosäkerhet nivå tre (BSL-3) villkor. Därför är det viktigt att optimera effektiviteten hos MEV-isoleringsme…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för att Rafael Prados-Rosales för att dela anti-MeV antiserum och Navneet dogra för att utföra nanopartiklar spårningsanalys.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
Referências
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
