Microsatellite DNA genotypning och flödescytometri Ploidy analyser av formalin-fast paraffin-inbäddade Hydatidiform molar vävnader
Summary
Hydatidiform mullvadar är onormala mänskliga graviditeter med heterogena etiologier som kan klassificeras enligt deras morfologiska egenskaper och föräldrarnas bidrag till molar Genomes. Här beskrivs protokoll för multiplex mikrosatelliten DNA genotypning och flödescytometri av formalin-fast paraffin-inbäddade molar vävnader i detalj, tillsammans med resultat ‘ tolkning och integration.
Abstract
Hydatidiform Mole (HM) är en onormal mänsklig graviditet kännetecknas av överdriven trofoblastisk proliferation och onormal embryonal utveckling. Det finns två typer av HM baserat på mikroskopisk morfologisk utvärdering, komplett HM (CHM) och partiell HM (PHM). Dessa kan delas upp ytterligare baserat på föräldrarnas bidrag till molar genomerna. Sådan karakterisering av HM, genom morfologi och genotyp analyser, är avgörande för patientens ledning och för den grundläggande förståelsen av denna spännande patologi. Det är väl dokumenterat att Morfologisk analys av HM är föremål för stor interobserver variation och är inte tillräckligt på egen hand för att korrekt klassificera HM i CHM och PHM och skilja dem från och icke-molar aborter. Genotypning analys utförs främst på DNA och vävnader från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) produkter av befruktningen, som har mindre än optimal kvalitet och kan därför leda till felaktiga slutsatser. I denna artikel tillhandahålls detaljerade protokoll för multiplex genotypning och flödescytometri analyser av FFPE molar vävnader, tillsammans med tolkningen av resultaten av dessa metoder, deras felsökning, och integration med den morfologiska utvärderingen , P57KIP2 immunohistokemi, och fluorescens in situ hybridisering (fisk) för att nå en korrekt och robust diagnos. Här delar författarna de metoder och lärdomar som har dragits under de senaste 10 åren från analysen av cirka 400 produkter av befruktningen.
Introduction
En hydatidiform mullvad (HM) är en onormal mänsklig graviditet kännetecknas av onormal embryonal utveckling, hyperproliferation av trofoblast, och och degeneration av korionvilli (CV). Historiskt, HM brukade delas in i två typer, komplett HM (CHM) och partiell HM (PHM) bygger endast på morfologisk utvärdering1. Emellertid, det har visats att morfologisk utvärdering ensam är inte tillräckligt för att klassificera HM i de två subtyperna (chm och PHM) och skilja dem från icke-molar missfall2,3,4.
Eftersom chm och PHM har olika benägenhet att maligniteter, är det därför viktigt att exakt bestämma genotypisk typ av HM för att ge lämplig uppföljning och förvaltning till patienterna. Under de senaste decennierna har därför flera metoder utvecklats och utvecklats i syfte att identifiera föräldra bidraget till molar vävnaderna och nå en korrekt klassificering av HM. Dessa inkluderar karyotyp analys, kromosomala banding polymorfism, humant leukocyt antigen (HLA) serologiska typning, begränsning fragment längd polymorfism, varierande antal tandem upprepningar, mikrosatelliten genotypning, flödescytometri, och P57 KIP2 immunohistokemi. Detta har tillåtit korrekt indelning av HM föreställningar baserat på föräldrarnas bidrag till deras genom, enligt följande: CHM, som är diploida Androgenetisk monospermic eller diploida Androgenetisk dispermic, och PHM, som är triploida, dispermic i 99% och monospermic i 1% av fallen5,6,7,8. Dessutom finns det en annan genotypisk typ av HM som dök upp under de senaste två decennierna, som är diploida biparental. Det sistnämnda är oftast återkommande och kan påverka en enda familjemedlem (simplex-fall) eller minst två familjemedlemmar (familjella fall). Dessa diploida biföräldra mullvadar orsakas främst av recessiva mutationer i NLRP7 eller KHDC3L hos patienterna9,10,11,12. Diploid från HM hos patienter med recessiva mutationer i NLRP7 kan diagnostiseras som chm eller PHM av Morfologisk analys och detta verkar vara förknippat med svårighetsgraden av mutationer i patienterna13,14. Förutom klassificeringen av HM enligt deras genotyper tillät införandet och användningen av flera genotypningsmetoder distinktionen mellan de olika molar-enheterna från icke-molara missfall, såsom aneuploida diploida biföräldrars befruktningar och andra typer av befruktningar5,15. Sådana föreställningar kan ha vissa trofoblastproliferation och onormal villösa morfologi som härma, i viss mån, några morfologiska egenskaper hos HM.
Syftet med denna artikel är att tillhandahålla detaljerade protokoll för multiplex genotypning och flödescytometri av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader, och omfattande analyser av resultaten av dessa metoder och deras integration med andra metoder för korrekt och avgörande diagnos av molar vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM är onormala mänskliga graviditeter med heterogena etiologier och har olika histologiska och genotypiska typer, vilket gör deras korrekta klassificering och diagnos utmanande. Histopatologisk morfologisk utvärdering har ofta visat sig vara felaktig och är därför opålitlig på egen hand för att klassificera HM i CHM och PHM och särskilja dem från icke-molara missfall. Därför kräver en korrekt diagnos av HM användning av andra metoder såsom multiplex mikrosatelliten DNA genotypning, ploiditeten analys av …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Sophie Patrier och Marianne Parésy för att de delar det ursprungliga flödescytometri-protokollet, och Promega och QIAGEN för att tillhandahålla varor och reagenser. Detta arbete stöddes av Réseau Québécois en reproduktion och det kanadensiska Institutet för hälsoforskning (MOP-130364) till R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Referências
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
