生产用于单分子观察的DNA折纸纳米结构的Dynein和Kinesin电机组合
Summary
该协议的目标是在DNA折纸纳米结构上形成分子马达组合，并使用全内反射荧光显微镜观察整体运动。
Abstract
细胞骨骼马达负责真核细胞的各种功能，包括线粒体、货物运输、细胞运动等。其中许多功能需要电机在组合中运行。尽管对单个细胞骨骼电机的机制有丰富的知识，但相对而言，对电机组合的机制和紧急行为知之甚少，例如，对组合过程和速度的变化。更改电机编号、位置和配置。结构DNA纳米技术，以及DNA折纸的特定技术，使电机组合的清晰结构的分子结构成为可能。货物结构的形状以及电机在结构上的类型、数量和位置都可以控制。在这里，我们提供详细的协议，用于生成这些集合，并使用总的内部反射荧光显微镜观察它们。尽管这些技术已专门应用于细胞骨骼电机，但这些方法可应用于在复合物中组装以完成任务的其他蛋白质。总体而言，DNA折纸法用于创建定义明确的运动蛋白组合，为解剖导致紧急活动性行为的机制提供了强有力的工具。
Introduction
Dynein和激酶是细胞骨骼运动蛋白，在真核细胞1中负责多种功能。通过将ATP水解的化学能转化为生产工作，这些电机在微管上转换，以运输和分配各种细胞内货物。他们还协调与线粒体相关的大规模细胞内重组，其中它们表现出有助于染色体定位和分离的编排力。结构、生化和生物物理检测，包括单分子观察，揭示了这些马达在个体层面的机制（在以前的工程2，3，4）中得到了很好的审查。但是，电机的许多任务要求它们在类似和混合电机类型的小集合中工作。相对而言，对这些合奏团5、6的活动和最终紧急运动机制的理解较少。这种知识差距部分是由于难以创建具有可控功能（如电机类型和拷贝号）的合奏。近十年来，DNA折纸的分子构造技术一直被用来解决这个问题。对于基于微管的电机，这些研究的一些例子包括细胞质dynein-17，8，9，内鞭抗dynein11的单分子观测，各种运动因子电机12，13，和混合的dyneins和激酶7，14，15。在这里，我们提供从酵母7，16，17，18，19，20，电机的纯化和寡核苷酸标签的详细信息。折叠和纯化分段的DNA折纸与可调的符合性8，和酵母马达的成像推动底盘结构7，18。
构建体外单分子观察的电机组合需要三个主要的努力。第一种是适合附着DNA折纸的电机结构的表达、纯化和标记。第二种是生产并纯化已定义的DNA折纸结构（通常称为”底盘”）。第三是电机与底盘结构的结合，然后使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜进行观察。在这里，我们为从酵母糖精7、16、17、18中纯化的重组微管基电机提供既定的协议。19.DNA折纸为基础的运动组合已被研究使用重组运动体15和dynein7，8，18结构产生在这个酵母表达系统16 ，17，18，19.该协议对这些结构有效，因为它们由乳突素诱导启动子控制，并融合到相同的蛋白质标记进行纯化（ZZ和TEV蛋白酶链接器）和DNA寡聚结合（SNAPtag）。
特定的酵母菌株产生特定的运动结构。例如，用于研究货物合规作用的dynein从应变RPY10847，8中纯化。一般来说，含有具有表达和纯化适当基因修饰的电机结构的菌株可以从公布使用这些马达的实验室要求。具有突变或标记等新特性的构造可以使用重组基因技术进行，例如醋酸锂转化21和商业试剂盒。为单分子研究在酵母中制造修饰的马达蛋白的详细方案已经发表于19。除了与 SNAPtag 融合的电机外，用于标记电机的寡聚物必须与 SNAP 基板苯基板（BG）结合使用;先前公布的协议描述了BG-寡聚物18的形成和纯化。此处描述的总体策略也用于基于actin的电机（参见前面的工作示例 22、23、24）和从其他生物体和表达系统纯化的电机（参见前一例作品的例子7，9，10，11，12，13，14。
聚合微管 （MT） 用于两种不同的实验过程。功能电机的 MT 亲和力纯化需要未与其他功能组标记的 MT，而电机组合运动 TIRF 测定要求标有生物锡和荧光团的 MT。在所有情况下，使用 taxol 稳定了 MT，以防止变性。MT 亲和力纯化步骤用于移除任何具有高 MT 亲和力的非移动电机，因为这些电机在与底盘结合时可以改变整体运动性。在此过程中，有源电机可解合 MT 并保持在溶液中，而紧密结合的电机在 MT 颗粒中向下旋转。这有助于确保机箱上的所有电机都来自活动总体。
各种DNA折纸结构已被用来研究细胞骨骼运动组合。随着对整体运输的机械认识的增加，实验中使用的DNA折纸结构也越来越复杂。原则上，任何结构都可以为此目的加以调整，只要它被修改为包括电机和荧光道的单链DNA连接位点。特定的底盘设计和属性对于探究有关电机组合的紧急行为的特定问题可能很有用。例如，硬棒已用于开发复制数如何影响组由 dyneins 和运动体7、15、18和 2D 平台组成的传输的基本知识，用于研究肌苷组合actin网络的导航22.具有可变或可调灵活性的结构已经用于理解电机之间弹性耦合的作用，并探讨步进同步如何影响运动性8，24。最近，球形结构被用来深入了解电机轨道绑定的几何约束如何影响运动25的动态。
在此协议中，我们为具有可变刚度的分段机箱上的集成实验提供了具体步骤。机箱上的绑定位点有时称为”句柄”，而绑定这些手柄的补充 DNA 序列称为”防手柄”。这些底盘上的电机数量取决于哪些段包含扩展手柄订书针，与寡核标记电机上的防手柄寡聚物具有互补性。在不同段使用不同的处理序列，允许将不同类型的电机绑定到机箱上的特定位置。此处详述的底盘由 7 个顺序刚性段组成，每个段由 12 个双链 DNA 螺旋组成，排列在 2 个同心环8中。刚性段包含电机手柄，并通过可具有柔性单链 DNA 或刚性双链 DNA 的区域连接，具体取决于”链接器”订书针的缺失或存在。因此，机箱结构的合规性取决于是否存在这些”链接器”订书针。有关更多详细信息和特定 DNA 序列8，请参阅以前的报告。此外，多种方法可用于净化机箱26。此处介绍了速率区甘油梯度离心方法27。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA折纸的分子构造技术提供了一种独特的方法来构建具有定义架构、电机编号和类型的电机组合，从而能够研究出位行为如何产生于特定的电机配置31。随着结构和细胞研究不断阐明细胞骨骼电机在团队中工作的例子，隔离和研究组合中电机的生物物理和生化机制的技术正在发挥作用。例如，Cryo-EM 已经表明，丁辛可以结合 2 个单独的 dynein 电机，并且这种配对具有不同于单个电?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢K.Chau、J.Morgan和A.Driller-Colangelo为分段DNA折纸底盘技术做出贡献。我们还感谢Reck-Peterson和Shih实验室的前成员为这些技术的最初发展进行了有益的讨论和贡献。我们感谢J.沃佩雷斯和史密斯学院显微镜和成像中心以及L.比尔韦特和史密斯学院分子生物学中心。我们非常感谢 NSF MRI 计划购置了 TIRF 显微镜。
Materials
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
Referências
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
- Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
- Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
- McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
- Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
- Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
- Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
- Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
- Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
- Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
- Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
- Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
- Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
- Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).
- Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
- Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).
- Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
- Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
- Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
- Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
- Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
- Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , (2019).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
