Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Abstract

Zytoskelettmotoren sind verantwortlich für eine Vielzahl von Funktionen in eukaryotischen Zellen, einschließlich Mitose, Frachttransport, Zellbewegung und andere. Viele dieser Funktionen erfordern Motoren, um in Ensembles zu arbeiten. Trotz einer Fülle von Kenntnissen über die Mechanismen einzelner Zytoskelettmotoren ist vergleichsweise weniger über die Mechanismen und das aufkommende Verhalten von Motorensembles bekannt, deren Beispiele Veränderungen der Ensemble-Prozessivität und -geschwindigkeit mit Motornummer, Standort und Konfiguration ändern. Die strukturelle DNA-Nanotechnologie und die spezifische Technik des DNA-Origami ermöglichen die molekulare Konstruktion klar definierter Architekturen von Motorensembles. Die Form der Ladungsstrukturen sowie die Art, Anzahl und Platzierung der Motoren auf der Struktur können alle gesteuert werden. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Herstellung dieser Ensembles und deren Beobachtung mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Verfügung. Obwohl diese Techniken speziell für Zytoskelettmotoren angewendet wurden, sind die Methoden auf andere Proteine verallgemeinert, die sich in Komplexen zusammensetzen, um ihre Aufgaben zu erfüllen. Insgesamt bietet die DNA-Origami-Methode zur Schaffung klar definierter Ensembles von motorischen Proteinen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu sezieren, die zu auftauchendem motilen Verhalten führen.

Introduction

Dynein und Kinesin sind zytoskelettale motorische Proteine, die für unzählige Funktionen in eukaryotischen Zellen verantwortlich sind¹. Durch die Umwandlung der chemischen Energie der ATP-Hydrolyse in produktive Arbeit, diese Motoren translozieren auf Mikrotubuli, um zu schleppen und zu verteilen verschiedene intrazelluläre Ladungen. Sie koordinieren auch in den massiven intrazellulären Umlagerungen im Zusammenhang mit Mitose, wo sie orchestrierte Kräfte aufweisen, die zur Positionierung und Trennung von Chromosomen beitragen. Strukturelle, biochemische und biophysikalische Assays, einschließlich Einzelmolekülbeobachtungen, haben die Mechanismen dieser Motoren auf individueller Ebene aufgedeckt (gut in früheren^Arbeiten2^,3,4). Viele der Aufgaben der Motoren erfordern jedoch, dass sie in kleinen Ensembles ähnlicher und gemischter Motortypen arbeiten. Vergleichsweise weniger wird über die Mechanismen verstanden, die die Aktivität und die endgültige Beweglichkeit dieser Ensembles koordinieren^5,6. Diese Wissenslücke ist zum Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, Ensembles mit steuerbaren Merkmalen wie Motortyp und Kopiernummer zu erstellen. In den letzten zehn Jahren wurden die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami eingesetzt, um dieses Problem zu lösen. Für die Mikrotubuli-basierten Motoren sind einige Beispiele dieser Untersuchungen einzelmolekulare Beobachtungen von Ensembles von zytoplasmatischem Dynein-17^,8,9, intraflagellar dynein¹¹, verschiedene Kinesinmotoren^12,13, und Mischungen von Dyneins und Kinesinen^7,14,15. Hier stellen wir Details der Reinigung und Oligonukleotid-Etikettierung von Motoren aus Hefe^{7,16,17,18,19,20}, die Faltung und Reinigung von segmentierten DNA-Origami mit abstimmbarer Konformität⁸und die Abbildung der Hefemotoren, die die Fahrwerksstrukturen^{antreiben 7,18}.

Die Konstruktion von Motorensembles für die In-vitro-Einzelmolekülbeobachtung erfordert drei Hauptanstrengungen. Die erste ist die Expression, Reinigung und Kennzeichnung von Motorkonstrukten, die für die Befestigung an DNA-Origami geeignet sind. Die zweite ist die Produktion und Reinigung definierter DNA-Origami-Strukturen (oft als “Chassis” bezeichnet). Und die dritte ist die Konjugation der Motoren an die Chassis-Struktur gefolgt von Beobachtung mit totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). Hier stellen wir etablierte Protokolle für diesen Prozess für rekombinante Mikrotubuli-basierte Motoren bereit, die aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18 gereinigt werden. 19}. DNA-Origami-basierte Motorensembles wurden sowohl mit rekombinanten Kinesin¹⁵ als auch mit Dynein^7,8,18 In diesem Hefeexpressionssystem hergestellten Konstrukten untersucht^{16 ,17,18,19}. Dieses Protokoll gilt für diese Konstrukte, da sie vom galaktoseinduzierten Promotor kontrolliert und mit denselben Protein-Tags zur Reinigung (ZZ und TEV Protease Linker) und für DNA-Oligokonjugation (SNAPtag) verschmolzen werden.

Spezifische Hefestämme erzeugen spezifische Motorkonstrukte. Zum Beispiel wurde das Dynein, das verwendet wurde, um die Rolle der Ladungskonformität zu untersuchen, von der Sorte RPY1084^7,8gereinigt. Im Allgemeinen können Stämme, die Motorkonstrukte mit den entsprechenden genetischen Modifikationen für die Expression und Reinigung enthalten, von den Laboratorien angefordert werden, die die Verwendung dieser Motoren veröffentlicht haben. Konstrukte mit neuartigen Attributen wie Mutationen oder Tags können mit rekombinanten genetischen Techniken wie Lithiumacetat-Transformation²¹ und kommerziellen Kits erstellt werden. Detaillierte Protokolle zur Herstellung modifizierter motorischer Proteine in Hefe für Einzelmolekülstudien wurden veröffentlicht¹⁹. Zusätzlich zu den Motoren, die mit dem SNAPtag verschmolzen werden, müssen die Oligos, die zur Kennzeichnung der Motoren verwendet werden, mit dem SNAP-Substrat Benzylguanin (BG) konjugiert werden; zuvor veröffentlichte Protokolle beschreiben die Bildung und Reinigung von BG-Oligo-Konjugaten¹⁸. Die hier beschriebene Gesamtstrategie wurde auch für actin-basierte Motoren (siehe frühere Arbeiten für Beispiele^22,23,24) und Motoren verwendet, die von anderen Organismen und Expressionssystemen gereinigt wurden (siehe vorherige arbeitet für Beispiele^{7,9,10,11,12,13,14}).

Polymerisierte Mikrotubuli (MTs) werden in diesen Experimenten in zwei verschiedenen Verfahren eingesetzt. Mt AffinitätSreinigung von Funktionsmotoren erfordert MTs, die nicht mit anderen funktionellen Gruppen gekennzeichnet sind, während die Motor-Ensemble-Motilität TIRF Assay MTs erfordert, die mit Biotin und Fluorophoren gekennzeichnet sind. In allen Fällen werden MTs mit Taxol stabilisiert, um eine Denaturierung zu verhindern. Der MT-Affinitätsreinigungsschritt wird verwendet, um alle nicht-motilen Motoren mit einer hohen MT-Affinität zu entfernen, da diese Motoren die Beweglichkeit des Ensembles verändern können, wenn sie mit einem Chassis konjugiert werden. Dabei binden aktive Motoren die MTs und bleiben in lösungsweise, während sich im MT-Pellet eng bindende Motoren drehen. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Motoren auf dem Chassis aus einer aktiven Population stammen.

Eine Vielzahl von DNA-Origami-Strukturen wurden verwendet, um zytoskelettale motorische Ensembles zu studieren. Mit zunehmendem mechanistischen Verständnis des Ensembletransports sind die in Experimenten verwendeten DNA-Origami-Strukturen immer komplexer geworden. Grundsätzlich könnte jede Struktur für diesen Zweck angepasst werden, sofern sie so geändert wird, dass sie einsträngige DNA-Anhaftungsstellen für Motoren und Fluorophore umfasst. Spezifische Chassis-Designs und Attribute können nützlich sein, um bestimmte Fragen über das auftauchende Verhalten von Motoren-Ensembles zu untersuchen. Zum Beispiel wurden starre Stäbe verwendet, um grundlegende Kenntnisse darüber zu entwickeln, wie die Kopiernummer den Transport von Teams von Dyneins und Kinesinen beeinflusst^7,15,18und 2D-Plattformen wurden verwendet, um Myosin-Ensemble zu studieren Navigation von actin-Netzwerken²². Strukturen mit variabler oder abstimmbarer Flexibilität wurden verwendet, um die Rollen der elastischen Kopplung zwischen Motoren zu verstehen und zu untersuchen, wie sich die Schrittsynchronisierung auf die Beweglichkeit^8,24auswirkt. In jüngerer Zeit werden sphärische Strukturen verwendet, um Einen Einblick in die Auswirkungen geometrischer Abhängigkeiten auf die Motor-Track-Bindung auf die Dynamik der Beweglichkeit²⁵zu gewinnen.

In diesem Protokoll bieten wir spezifische Schritte für Ensembleexperimente an segmentierten Chassis mit variabler Steifigkeit an. Bindungsstellen auf dem Chassis werden manchmal als “Griffe” bezeichnet, während ergänzende DNA-Sequenzen, die diese Griffe binden, als “Antihandles” bezeichnet werden. Die Anzahl der Motoren auf diesen Chassis wird bestimmt, welche Segmente verlängerte Griffklammern mit Komplementarität zum Antihandle-Oligo auf den Oligo-markierten Motoren enthalten. Die Verwendung unterschiedlicher Griffsequenzen auf verschiedenen Segmenten ermöglicht die Bindung verschiedener Motorentypen an bestimmte Stellen auf dem Chassis. Das hier beschriebene Chassis besteht aus 7 aufeinanderfolgenden starren Segmenten, die jeweils aus 12 doppelsträngigen DNA-Helices bestehen, die in 2 konzentrischen Ringen⁸angeordnet sind. Die starren Segmente enthalten die Motorgriffe und sind durch Regionen verbunden, die entweder flexible einsträngige DNA oder starre doppelsträngige DNA sein können, je nach Abwesenheit bzw. Vorhandensein von “Linker”-Heftklammern. Die Übereinstimmung der Fahrwerksstruktur wird somit durch das Vorhandensein oder Fehlen dieser “Linker”-Heftklammern bestimmt. Weitere Informationen und spezifische DNA-Sequenzen finden Sie in früheren Berichten⁸. Darüber hinaus können mehrere Methoden verwendet werden, um Chassis²⁶zu reinigen. Hier wird die rate-zonale Glyzeringradientenzentrifugationsmethode²⁷ beschrieben.

Protocol

1. Wachstum, Expression und Ernte von motorischen Proteinen, die von einem Galactose-induzierten Promotor gesteuert werden Mit einer Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Kulturplatte und einem sterilen Impfstab, Streifen gewünschte gefrorene Hefe-Stamm und inkubieren für 3-4 Tage bei 30 °C. Tag 1 des Kulturwachstums: Am Nachmittag 10 ml YP-Kulturmedien mit 2% Dextrose zu einem Glaskulturrohr mit 1″ Durchmesser hinzufügen und mit einer einzigen Kolonie von der Platte impfen. Wachsen Sie in einer schnell roti…

Representative Results

Erfolgreiche Reinigungen von Motoren und Fahrwerksstrukturen wurden durch Gelelektrophorese geprüft. Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte die erfolgreiche Extraktion von Farbstoff aus Hefe (Abbildung 2), da das in Schritt 2.3.7 gesammelte Endfiltrat ein klares, scharfes Band an der Position von 350 kDa zeigte. Wie erwartet, fehlte dieses Dynein-Band in der Durchfluss- und Waschung, die unerwünschte Proteine entfernte, und den Perlen, von denen Dynein spaltete. …

Discussion

Die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami bieten eine einzigartige Möglichkeit, Motorensembles mit definierten Architekturen, Motorzahlen und Typen zu konstruieren, was Studien darüber ermöglicht, wie das entstehende Verhalten aus bestimmten Motorkonfigurationen entsteht³¹. Da strukturelle und zelluläre Studien weiterhin Beispiele von Zytoskelettmotoren aufklären, die in Teams arbeiten, werden Techniken zur Isolierung und Untersuchung der biophysikalischen und biochemischen Mecha…

Materials

2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090