단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산
Summary
이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.
Abstract
Cytoskeletal 모터는 진핵 세포에 있는 다양한 기능에 책임 있습니다, 유사분열, 화물 수송, 세포 운동성, 및 그 외를 포함하여. 이러한 기능 의 대부분은 앙상블에서 작동 모터가 필요합니다. 개별 cytoskeletal 모터의 메커니즘에 대한 풍부한 지식에도 불구하고, 상대적으로 적은 모터 앙상블의 메커니즘과 출현 행동에 대해 알려져있다, 그 예로 는 앙상블 프로세스성 및 속도에 대한 변화를 포함 모터 번호, 위치 및 구성을 변경합니다. 구조 DNA 나노 기술 및 DNA 종이 접기의 특정 기술은 모터 앙상블의 잘 정의 된 아키텍처의 분자 구조를 가능하게합니다. 화물 구조의 모양뿐만 아니라 구조에 모터의 유형, 수 및 배치를 모두 제어 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 이 앙상블을 생성하고 총 내부 반사 형광 현미경 검사법을 사용하여 그(것)들을 관찰하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 기술은 특히 세포골격 모터에 적용되었지만, 방법은 자신의 작업을 수행하기 위해 복합체에서 조립하는 다른 단백질에 일반화 할 수 있습니다. 전반적으로, 모터 단백질의 잘 정의된 앙상블을 만들기 위한 DNA 종이 접기 방법은 출현한 운동성 행동으로 이끌어 내는 기계장치를 해부하기 위한 강력한 공구를 제공합니다.
Introduction
다인과 키네신은 진핵 세포에 있는 무수한 기능에 책임 있는 세포골격 모터 단백질1. ATP 가수분해의 화학 적 에너지를 생산적인 작업으로 변환함으로써, 이 모터는 다양한 세포 내 화물을 운반하고 분배하기 위해 미세 소관에 전이합니다. 그(것)들은 또한 염색체의 위치 그리고 분리에 기여하는 편케한 힘을 전시하는 유사분열과 관련되었던 거대한 세포내 재배열에서 조정합니다. 단일 분자 관찰을 포함한 구조적, 생화학적 및 생화학적 분석을 통해 개별 수준에서 이러한 모터의 메커니즘이 밝혀졌습니다(전작2,3,4에서잘 검토됨). 그러나 모터의 많은 작업은 유사 모터 유형과 혼합 모터 유형의 작은 앙상블에서 작동하도록 요구합니다. 비교적 적은 이러한 앙상블의 활성 및 궁극적 인 출현 운동성을 조정하는 메커니즘에 대해 이해5,6. 이러한 지식 격차는 부분적으로 모터 유형 및 복사 번호와 같은 제어 가능한 기능을 갖춘 앙상블을 만드는 데 어려움이 있기 때문입니다. 지난 10 년 동안, DNA 종이 접기의 분자 건설 기술은이 문제를 해결하기 위해 채택되었습니다. 미세소관 계 모터의 경우, 이러한 조사의 몇 가지 예는 세포질 다인-17,8,9,intraflagellar dynein11의앙상블의 단일 분자 관찰을 포함한다. 다양한 키네신 모터12,13,및 다인및 키네신의 혼합물7,14,15. 여기에, 우리는 효모7,16,17,18,19,20에서모터의 정제 및 올리고 뉴클레오티드 라벨링의 세부 사항을 제공합니다. 접이식 및 정제 분할 된 DNA 종이 접기의 조정 준수8,및 섀시 구조를 추진 효모 모터의 이미징7,18.
시험관 내 단일 분자 관찰을 위한 모터 앙상블을 건설하려면 3차적인 노력이 필요합니다. 첫 번째는 DNA 종이 접기에 부착하기에 적합한 모터 구조의 발현, 정제 및 라벨링입니다. 두 번째는 정의 된 DNA 종이 접기 구조의 생산 및 정제 (종종 “섀시”라고도 합니다). 그리고 세 번째는 전체 내부 반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 관찰한 후 섀시 구조에 모터를 융합하는 것입니다. 여기서, 우리는 효모 사카로마이세스 세레비시아7, 16,17,18, 19. DNA 종이 접기 계 모터 앙상블은 재조합 키네신15 및 다인7,8,18 구성을 모두 사용하여 이 효모 발현 시스템에서 생산된구조(16)를 사용하여 조사되었다. ,17,18,19. 이 프로토콜은 갈락토제 유도 프로모터에 의해 제어되고, 정제(ZZ 및 TEV 프로테아제 링커) 및 DNA 올리고 어버전(SNAPtag)을 위한 동일한 단백질 태그에 융합된다는 점을 감안할 때 이들 구조에 대해 유효하다.
특정 효모 균주는 특정 모터 구조를 생성합니다. 예를 들어, 화물 순응의 역할을 연구하는 데 사용되는 다인은 변형성 RPY10847,8로부터정제되었다. 일반적으로, 발현 및 정제를 위한 적절한 유전자 변형을 갖는 모터 구조를 포함하는 균주는 이들 모터의 사용을 공표한 실험실로부터 요청될 수 있다. 돌연변이 또는 태그와 같은 새로운 특성을 갖는 구조는 리튬 아세테이트형질전환(21) 및 상용 키트와 같은 재조합 유전 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 단일 분자 연구를 위한 효모에서 변형된 모터 단백질을 만들기 위한 상세한 프로토콜은19. SNAPtag에 융합되는 모터 이외에, 모터를 라벨에 사용하는 올리고는 SNAP 기판, 벤질구아닌 (BG)에 공액되어야 합니다; 이전에 출판된 프로토콜은 BG-올리고접합부(18)의형성 및 정제를 기술한다. 여기에 설명된 전체 전략은 액틴 기반 모터(예:22,23,24참조) 및 다른 유기체 및 발현 시스템에서 정제된 모터(이전 참조)에도 사용되었습니다. 예제 7,9,10,11,12,13,14)에서작동합니다.
중합 된 미세 소관 (MTs)은 두 가지 다른 절차에서 이러한 실험에 사용됩니다. 기능성 모터의 MT 친화도 정제는 다른 작용기와 함께 라벨이 부착되지 않은 MT를 필요로 하며, 모터 앙상블 운동성 TIRF 분석법은 비오틴과 형광로광으로 표시된 MT를 필요로 합니다. 모든 경우에, MT는 변이를 방지하기 위해 탁솔으로 안정화됩니다. MT 선호도 정제 단계는 이러한 모터가 섀시에 컨쥬게이션된 경우 앙상블 운동성을 변경할 수 있기 때문에 MT 친화성이 높은 비운동성 모터를 제거하는 데 사용됩니다. 이 과정에서 액티브 모터는 MT를 결합해제하고 용액에 남아 있는 반면, 타이트 바인딩 모터는 MT 펠릿에서 스핀다운됩니다. 이를 통해 섀시에 있는 모든 모터가 활성 집단에서 온 것을 확인할 수 있습니다.
다양한 DNA 종이 접기 구조가 세포골격 모터 앙상블을 연구하는 데 사용되었습니다. 앙상블 수송의 기계론적인 이해가 증가함에 따라, 실험에서 채택된 DNA 종이 접기 구조물은 복잡성에서 증가했습니다. 원칙적으로, 모든 구조는 모터 및 형광단에 대한 단일 가닥 DNA 부착 부위를 포함하도록 변형되는 경우 이러한 목적을 위해 적응될 수 있다. 특정 섀시 설계 및 특성은 모터 앙상블의 긴급 한 동작에 대 한 특정 질문을 검색하는 데 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 단단한 막대는 카피 수가 다인과 키네신7,15,18및 2D 플랫폼의 팀에 의한 수송에 미치는 영향에 대한 기초 지식을 개발하는 데 사용되어 미오신 앙상블을 연구하는 데 사용되었습니다. 액틴 네트워크22의네비게이션 . 가변 또는 튜닝 가능한 유연성을 가진 구조는 모터 간의 탄성 결합의 역할을 이해하고 스테핑 동기화가 운동성8,24에미치는 영향을 조사하는 데 사용되었습니다. 최근에는 구형 구조가 모터 트랙 바인딩에 대한 기하학적 제약조건이 운동성25의역학에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되고 있습니다.
이 프로토콜에서는 가변 강성을 가진 분할된 섀시에 대한 앙상블 실험을 위한 특정 단계를 제공합니다. 섀시에 바인딩 사이트는 때때로 “핸들”이라고, 이러한 핸들을 바인딩 하는 상보적인 DNA 서열 은 “안티 핸들”이라고 합니다. 이 섀시에 있는 모터의 수는 올리고 라벨이 부착된 모터의 안티핸들 올리고에 대한 상보성을 갖춘 확장된 핸들 스테이플을 포함하는 세그먼트에 의해 결정됩니다. 서로 다른 세그먼트에서 서로 다른 핸들 시퀀스를 사용하면 섀시에서 특정 위치에 다양한 유형의 모터를 바인딩할 수 있습니다. 여기에 상세한 섀시는 7 개의 순차적 강성 세그먼트로 구성되며, 각각 2 개의 동심원8에배치 된 12 개의 이중 가닥 DNA 나선으로 구성됩니다. 단단한 세그먼트는 모터 손잡이를 포함하고 “링커” 스테이플의 부재 또는 존재에 따라 유연한 단일 가닥 DNA 또는 단단한 이중 가닥 DNA일 수 있는 지구를 통해 연결됩니다. 섀시 구조의 준수는 이러한 “링커” 스테이플의 유무에 의해 결정됩니다. 자세한 내용 및 특정 DNA서열8에대한 이전 보고서를 참조하십시오. 또한, 여러 가지 방법을 사용하여섀시(26)를정화할 수 있다. 속도-글리세롤 그라데이션 원심분리방법(27)은 여기에 기재되어 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 종이 접기의 분자 구성 기술은 정의 된 아키텍처, 모터 번호 및 유형으로 모터 앙상블을 구성하는 독특한 방법을 제공하여 특정 모터 구성31에서출현 하는 행동이 어떻게 발생하는지에 대한 연구를 가능하게합니다. 구조 및 세포 연구가 팀에서 작동하는 세포골격 모터의 예를 계속 해명함에 따라 앙상블에서 모터의 생물 물리학 및 생화학 적 메커니즘을 격리하고 조사하는 기…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 분할 된 DNA 종이 접기 섀시의 기술에 기여 K. 차우, J. 모건, A. 드릴러 – 콜란젤로 감사합니다. 우리는 또한 이러한 기술의 원래 개발에 도움이 토론과 기여에 대한 렉 피터슨과 시 연구소의 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 J. Wopereis와 현미경 검사법 및 화상 진찰을 위한 스미스 대학 센터 및 L. Bierwert 및 분자 생물학을 위한 스미스 대학 센터를 감사합니다. 우리는 TIRF 현미경의 취득을 위한 NSF MRI 프로그램을 감사하게 인정합니다.
Materials
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
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