मानव भ्रूण स्टेम सेल से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक स्थिर स्व-निर्देशित विधि
Summary
यह प्रोटोकॉल अभी भी मस्तिष्क कोशिका प्रकार ों की विविधता और सेलुलर संगठन की कई विशेषताओं को बनाए रखते हुए एक्सोजेनस विकास कारकों या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बिना एक सरलीकृत, कम लागत वाले तरीके से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उत्पादन करने के साधन के रूप में उत्पन्न किया गया था।
Abstract
भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से विभेदित मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड त्रि-आयामी प्रणाली में कई कोशिका प्रकारों की जटिल बातचीत का अध्ययन करने का अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। यहां हम एक अपेक्षाकृत सरल और सस्ती विधि पेश करते हैं जो मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड की पैदावार करता है। इस प्रोटोकॉल में मानव pluripotent स्टेम सेल एकल कोशिकाओं के बजाय छोटे समूहों में टूट रहे है और एक विषमलोगोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या बहिर्जात विकास कारकों के बिना बुनियादी मीडिया में उगाया जाता है, आंतरिक विकास संकेतों को आकार देने की अनुमति ऑर्गेनोइड का विकास। यह सरल प्रणाली मस्तिष्क कोशिकाओं, स्टेम कोशिकाओं, और अग्रमस्तिष्क, मिडब्रेन और हिंदब्रेन के न्यूरॉन्स सहित मस्तिष्क कोशिका प्रकारों की विविधता पैदा करती है। इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न ऑर्गेनोइड ्स ब्राइटफील्ड छवियों, हिस्टोलॉजी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया द्वारा प्रदर्शित उपयुक्त अस्थायी और स्थानिक संगठन की पहचान भी प्रदर्शित करता है ( क्यूआरटी-पीसीआर) । क्योंकि इन ऑर्गेनॉइड में मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों से कोशिका प्रकार होते हैं, इसलिए उनका उपयोग कई बीमारियों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हाल ही में एक पेपर में हमने मानव मस्तिष्क पर हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न ऑर्गेनॉइड के उपयोग का प्रदर्शन किया। इस दृष्टिकोण का उपयोग न्यूरोडेवलपमेंटल बाधाओं, आनुवंशिक विकारों और न्यूरोलॉजिक रोगों जैसी स्थितियों का अध्ययन करने के लिए अन्यथा कठिन की एक सरणी की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
असंख्य व्यावहारिक और नैतिक सीमाओं के कारण मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने में काफी कठिनाई हुई है । जबकि कृंतक का उपयोग अध्ययन मानव मस्तिष्क के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण रहा है, माउस मस्तिष्क में कई विसंगतियांहैं1,2। दिलचस्प बात यह है कि चूहों में एक न्यूरोनल घनत्व होता है जो रहनुमा मस्तिष्क3,4से कम 7 गुना कम होता है। हालांकि वानरों एक विकासवादी दृष्टिकोण से कृंतक की तुलना में मनुष्यों के करीब हैं, यह ज्यादातर शोधकर्ताओं के लिए व्यावहारिक नहीं है उनके साथ काम करते हैं । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मस्तिष्क कोशिका विविधता और सेलुलर संगठन को बनाए रखते हुए विषमलोगोस बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स या एक्सोजेनस विकास कारकों की आवश्यकता के बिना एक सरलीकृत और कम महंगी विधि का उपयोग करके मानव मस्तिष्क की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को फिर से तैयार करना था।
ससाई प्रयोगशाला से प्रारंभिक कार्य ने सिग्नलीकृत भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएससी)5,6से दो और त्रि-आयामी न्यूरोनल सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए भ्रूणीय निकायों (SFEBq) विधि की सीरम मुक्त संस्कृति का उपयोग किया। कई मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड तरीकों ने सिग्नल्ड ईएससी7,8से अपेक्षाकृत समान मार्ग का अनुसरण किया है । इसके विपरीत, यह प्रोटोकॉल अलग मानव ESCs (hESCs) के समूहों के साथ शुरू होता है, जो चढ़ाना चरण9,10 से पहले थॉमसन और झांग प्रयोगशालाओं के मौलिक काम के प्रारंभिक चरणों के समान हैऔरसाथ ही बहिर्जात विकास कारकों के अलावा11से पहले पास्का प्रयोगशाला के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरण के समान है । बेसमेंट झिल्ली मैट्रिस (उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स) का उपयोग कई मस्तिष्क ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल में किया गया है और इसे एक प्रभावी पाड़8दिखाया गया है। हालांकि, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तहखाने झिल्ली मैट्रिस जटिलताओं के बिना नहीं आते हैं क्योंकि वे उत्पादन12के दौरान बैच परिवर्तनशीलता के लिए बैच के साथ विकास कारकों की अज्ञात मात्रा के साथ सह-शुद्ध होते हैं। इसके अलावा, ये मैट्रिस इमेजिंग को जटिल बना सकते हैं, और संदूषण और लागत के जोखिम को बढ़ा सकते हैं।
जबकि मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उपयोग कई सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है, ध्यान में रखने के लिए कुछ सीमाएं हैं। एक के लिए, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से शुरू, ऑर्गेनोइड अधिक बारीकी से वृद्ध दिमाग की तुलना में अपरिपक्व दिमाग के समान है और इस तरह अल्जाइमर रोग की तरह बुढ़ापे में होने वाली बीमारियों के लिए आदर्श मॉडल नहीं हो सकता है । दूसरा, जबकि हमारे प्रोटोकॉल में फोरब्रेन, मिडब्रेन और हिंदब्रेन विकास के मार्कर मिले जो संगीत कार्यक्रम में कई मस्तिष्क क्षेत्रों से कोशिकाओं पर उपचार या बीमारी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, अन्य प्रोटोकॉल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों13,14पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पालन किया जा सकता है। अंत में, ऑर्गेनॉइड मॉडल की एक और सीमा आकार की है, जबकि मानव मस्तिष्क की औसत लंबाई लगभग 167 मिमी, आंदोलन के उपयोग के साथ बने मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड 4 मिमी8 तक बढ़ते हैं और इस प्रोटोकॉल द्वारा गठित ऑर्गेनॉइड 10 सप्ताह तक 1-2 मिमी तक बढ़ जाते हैं। फिर भी, यह प्रोटोकॉल मानव मस्तिष्क के ऊतकों और कई कोशिका प्रकारों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के समान, यह एक कृत्रिम प्रणाली है जो कई चेतावनी के साथ आती है। यद्यपि समग्र अभिव्यक्ति के स्तर के संदर्भ में बैच भिन्नता के लिए थोड़ा बैच था, व्यक्तिगत ऑर्गेनॉइड ने मतभेदों को प्रदर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सहायता के लिए येल स्टेम सेल कोर (वाईसीसी), और येल कैंसर सेंटर (वाईसीसी) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ जंग किम को उनकी न्यूरोपैथोलॉजी समीक्षा के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को कनेक्टिकट पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान कोष, मार्च ऑफ डिम्स, और NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), येल कैंसर केंद्र और येल कैंसर जीव विज्ञान प्रशिक्षण कार्यक्रम NCI CA193200 (E.B.) और यूसुफ और यूसुफ से एक उदार अप्रतिबंधित उपहार द्वारा समर्थित किया गया था और ल्यूसिले माद्री।
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
Referências
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