一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法

Summary

该协议是作为一种以简化、低成本的方式生产脑器官的方法，没有外源性生长因子或基底膜基质，同时仍然保持脑细胞类型的多样性和细胞组织的许多特征。

Abstract

与胚胎干细胞不同的人脑器官为研究三维系统中多种细胞类型的复杂相互作用提供了独特的机会。在这里，我们提出了一个相对简单和廉价的方法，产生大脑器官。在本协议中，人类多能干细胞被分解成小簇，而不是单个细胞，在基本培养基培养基中生长，没有异质基底膜基质或外源性生长因子，允许内在发育线索形成有机物的生长。这个简单的系统产生多种脑细胞类型，包括胶质和微胶质细胞、干细胞和前脑、中脑和后脑的神经元。该协议生成的有机体还显示了适当的时空组织特征，这些特征通过明场图像、组织学、免疫荧光和实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。由于这些有机物含有来自大脑各个部位的细胞类型，它们可用于研究多种疾病。例如，在最近的一篇论文中，我们演示了利用从这个协议生成的有机体来研究缺氧对人脑的影响。这种方法可用于研究一系列其他难以研究的条件，如神经发育障碍、遗传性疾病和神经疾病。

Introduction

由于无数的实际和伦理限制，在研究人脑方面遇到了很大的困难。虽然利用啮齿动物的研究对于我们了解人脑至关重要，但老鼠脑却^{有许多不同。}有趣的是，老鼠的神经元密度至少是灵长类脑^3、4的7倍。虽然从进化的角度来看，灵长类动物比啮齿动物更接近人类，但大多数研究人员与它们合作是不现实的。该协议的目的是使用简化且成本较低的方法重新概括人脑的许多重要特征，而无需异质基底膜基质或外源性生长因子，同时保持脑细胞多样性和细胞组织。

Sasai实验室的造形工作使用胚胎体无血清培养法（SFEBq）方法，从信号胚胎干细胞（ESCs）5、6生成二维和三维神经元细胞类型。许多人脑器官方法都遵循了一个相对相似的路径，从信号ESCs^7，8。相反，该协议从分离的人类ESCs（hESCs）开始，类似于在电镀步骤^9、10之前汤姆森和张实验室的开创性工作的初始步骤，以及Pasca实验室在添加外源性生长因子¹¹之前的大脑有机体协议的初始步骤。基底膜基质（例如，母体凝胶）已用于许多脑器官协议，并已被证明是一个有效的支架^8。然而，最常用的基底膜基质基质并非没有并发症，因为它们与未知数量的生长因子共同纯化，在生产过程中分批到批次变异^。此外，这些矩阵会使成像复杂化，并增加污染风险和成本。

虽然人脑器官可以用来回答许多问题，但有一定的局限性要记住。首先，从胚胎干细胞开始，器官比老年大脑更类似于不成熟的大脑，因此可能不是老年疾病（如阿尔茨海默氏症）的理想模型。其次，虽然我们的协议发现了前脑、中脑和后脑发育的标记物，这些标记有助于研究治疗或疾病对来自多个大脑区域的细胞的影响，但可以遵循其他协议，以专注于特定的大脑区域^13、14。最后，有机体模型的另一个限制是大小，而人脑的平均长度约为167毫米，使用搅拌使大脑器官增长到4毫米⁸和由该协议形成的器官增长到1-2毫米10周。尽管如此，该协议为研究人类脑组织和多种细胞类型的相互作用提供了重要工具。

Protocol

1. 干细胞维持 根据制造商的说明，在生长因子减少的层上保持H9 hESC（参见材料表，以后简称矩阵）。 要涂覆一个 6 孔板或一个 10 厘米的盘子，请将 100 μL 的基质与 5.9 mL 的冰冷 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM）/F12 介质相结合。将板包裹在石蜡薄膜中，并在 4°C 下存放过夜。在过量的基质/培养基被吸进后，第二天使用它们进行传交细胞。 以大约每 7 天 1：…

Representative Results

图 1显示了多个时间点的代表性亮场图像，以演示细胞/有机体在协议的不同阶段的外观。hESCs被从组织培养板中取出，分解成小块，并放置在T75超低附着瓶中，在那里形成球体。需要注意的是，这些细胞看起来明亮，大小相似，这些簇的中心没有黑暗的垂死细胞。细胞逐渐断掉bFGF。第5天，他们被安置在神经诱导介质中，在整个文化时期，他们一直留在这种媒介中。虽然随着…

Discussion

与其他有机体模型类似，这是一个带有几个警告的人工系统。虽然在整体表达水平上几乎没有批次变化，但单个器官确实表现出差异。例如，Sox-2 阳性区域的位置在每一个有机体中并不相同（图 3）。虽然qPCR适合寻找细胞批次的整体变化，但附加技术，如单细胞RNAaq，将在今后的研究中使用，以逐细胞收集更多信息。这个系统的另一个限制是，它没有像最近的一些研究17、18、19那样，…

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814