マイクロウェル培養を用いた精巣特異的建築を用いたブタ精巣オルガノイドの生成
Summary
ここでは、市販のマイクロウェル培養システムを用いた精巣特異的組織アーキテクチャを用いたブタ精巣オルガノイドの再現可能な生成のためのプロトコルを提示する。
Abstract
オルガノイドは、組織の構造と生体内の器官の機能を要約することができる複数の細胞タイプで構成される3次元構造です。オルガノイドの形成は、基礎研究と翻訳研究の異なる道を開きました。近年、精巣オルガノイドは男性の生殖生物学の分野に関心を集めています。精巣オルガノイドは、細胞間相互作用、組織発達、および生殖細胞ニッチ微小環境の研究を可能にし、高スループット薬と毒性スクリーニングを容易にする。精巣特異的組織アーキテクチャを用いて精巣オルガノイドを確実かつ再現可能に生成する方法が必要である。マイクロウェル培養システムには、ピラミッド型マイクロウェルの密集した配列が含まれています。思春期前精巣に由来する精巣細胞は、これらのマイクロウェルに遠心分離され、精巣特異的組織構造および細胞関連を有する精巣オルガノイドを生成するために培養される。このプロセスを介して何千もの均質なオルガノイドを生成することができます。ここで報告されたプロトコルは、男性の生殖を研究する研究者に広く関心を持つことになります。
Introduction
近年、3次元(3D)オルガノイドへの関心が復活している。腸1、胃2、膵臓3、4、肝臓5、脳6などの異なる臓器は、3Dオルガノイド系に正常に誘導されている。これらのオルガノイドは、生体内の器官と建築的および機能的類似性を持ち、単層培養システム7よりも組織微小環境の研究に生物学的に関連している。その結果、精巣オルガノイドも同様に関心を集め始めている、8,9,10,11,12.これまでに報告された方法の大半は、複雑で非高スループット10であり、ECMタンパク質8、10の添加を必要とする。この複雑さはまた、再現性の問題につながります。精巣の精巣のような細胞関連を持つ精巣オルガノイドの生成を可能にする簡単で再現可能な方法が必要です。
我々は最近、これらの要件12に対処するシステムを報告しました.豚をモデルに、マイクロウェルシステムに遠心強制集約アプローチを採用しました。マイクロウェルシステムでは、各ウェルには多数の同一の小さなマイクロウェル13が含まれています。これは均一なサイズの多数の球形の生成を可能にする。マイクロウェルシステムは精巣特異的な建築が付いている多数の均一なオルガノイドの発生を可能にした。システムは簡単であり、ECMタンパク質の添加を必要としない。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、生体内12の精巣に類似した組織アーキテクチャを持つ多数の精巣オルガノイドの一貫した、反復可能な生成を可能にする簡単な方法を確立した。このアプローチはブタ精巣細胞を用いて開発されたが、マウス、非ヒト霊長類およびヒト精巣12にもより広く適用可能である。精巣オルガノイド8、9、10、11<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH/NICHD HD091068-01が稲田ドブリンスキー博士に支援されました。
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
Referências
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