Generazione di organoidi testicolari porcini con Architettura Specifica Testis utilizzando Microwell Culture
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la generazione riproducibile di organoidi testicolari porcini con testicoli specifici architettura tissutale utilizzando il sistema di coltura microwell disponibile in commercio.
Abstract
Gli organiidi sono strutture tridimensionali composte da più tipi di cellule che sono in grado di ricapitolare l’architettura del tessuto e le funzioni degli organi in vivo. La formazione di organoidi ha aperto diverse vie di ricerca di base e traslazionale. Negli ultimi anni, gli organoidi testicolari hanno suscitato interesse nel campo della biologia riproduttiva maschile. Gli organoidi testicolari consentono lo studio delle interazioni cellula-cellula, dello sviluppo dei tessuti e del microambiente di nicchia delle cellule germinali e facilitano lo screening dei farmaci e della tossicità ad alto consumo. È necessario un metodo per generare in modo affidabile e riproducibile organoidi testicolari con architettura tissutale specifica di testicoli. Il sistema di coltura dei micropozzi contiene una vasta gamma di micropozzi a forma di piramide. Le cellule testicolari derivate da testicoli pre-puberali sono centrizzate in questi micropozzi e coltivate per generare organoidi testicolari con architetture tissutali specifiche per testicoli e associazioni cellulari. Migliaia di organoidi omogenei possono essere generati attraverso questo processo. Il protocollo qui riportato sarà di ampio interesse per i ricercatori che studiano la riproduzione maschile.
Introduction
Negli ultimi anni, c’è stata una rinascita di interesse per gli organoidi tridimensionali (3D). Diversi organi come intestino1, stomaco2, pancreas3,4, fegato5, e cervello6 sono stati derivati con successo in sistemi organoidi 3D. Questi organoidi hanno somiglianze architettoniche e funzionali con gli organi in vivo e sono più biologicamente rilevanti per lo studio del microambiente tissutale rispetto ai sistemi di coltura monostrato7. Di conseguenza, gli organoidi testicolari hanno iniziato a raccogliere interesse anche8,9,10,11,12. La maggior parte dei metodi riportati finora sono complessi, non-alto throughput10 e richiedono l’aggiunta di proteine ECM8,10. Questa complessità porta anche a problemi di riproducibilità. È necessario un metodo semplice e riproducibile che consenta la generazione di organoidi testicolari con associazioni cellulari che sono come testis in vivo.
Recentemente abbiamo segnalato un sistema per soddisfare questi requisiti12. Utilizzando il maiale come modello, abbiamo impiegato un approccio di aggregazione forzata centrifuga nel sistema del microwell. Nel sistema di microwell, ogni pozzo contiene un gran numero di micropozzi più piccoli identici13. Questo permette la generazione di numerosi sferoidi di dimensioni uniformi. Il sistema di microwell ha permesso la generazione di un gran numero di organoidi uniformi con un’architettura specifica per i testicoli. Il sistema è semplice e non richiede l’aggiunta di proteine ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo stabilito un metodo semplice che permette la generazione coerente e ripetibile di un gran numero di organoidi testicolari con architettura tissutale che è simile a testis in vivo12. Mentre l’approccio è stato sviluppato utilizzando cellule testis porcine, è più ampiamente applicabile anche al topo, al primate non umano e al testicolo umano12. Un certo numero di metodi diversi sono stati segnalati per la produzione di organoidi testicolari8</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NICHD HD091068-01 alla dott.ssa Ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
Referências
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