Génération d'organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de Testis utilisant la culture de Microwell
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la génération reproductible des organoïdes testiculaires porcins avec l’architecture spécifique de tissu de testicule utilisant le système commercial disponible de culture de microwell.
Abstract
Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles composées de plusieurs types de cellules qui sont capables de récapituler l’architecture tissulaire et les fonctions des organes in vivo. La formation d’organoïdes a ouvert différentes voies de recherche fondamentale et translationnelle. Ces dernières années, les organoïdes testiculaires ont suscité l’intérêt dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine. Les organoïdes testiculaires permettent l’étude des interactions cellules-cellules, du développement des tissus et du microenvironnement de niche des cellules germinales et facilitent le dépistage des médicaments à haut débit et de la toxicité. Une méthode est nécessaire pour générer de façon fiable et reproductible des organoïdes testiculaires avec l’architecture spécifique de tissu de testicule. Le système de culture des micropuits contient un réseau dense de micropuits en forme de pyramide. Les cellules testiculaires dérivées des testicules pré-puberté sont centrifugeuses dans ces micropuits et cultivées pour produire des organoïdes testiculaires avec l’architecture de tissu testis-spécifique et les associations cellulaires. Des milliers d’organoïdes homogènes peuvent être générés par ce processus. Le protocole rapporté ici sera d’un grand intérêt pour les chercheurs qui étudient la reproduction masculine.
Introduction
Ces dernières années, il y a eu un regain d’intérêt pour les organoïdes tridimensionnels (3D). Différents organes tels que l’intestin1, estomac2, pancréas3,4, foie5, et le cerveau6 ont été avec succès dérivés dans les systèmes organoïdes 3D. Ces organoïdes ont des similitudes architecturales et fonctionnelles avec les organes in vivo et sont plus biologiquement pertinents pour l’étude du microenvironnement tissulaire que les systèmes de culture monocouches7. En conséquence, organoïdes testiculaires ont commencé à susciter l’intérêt ainsi8,9,10,11,12. La majorité des méthodes signalées jusqu’à présent sont complexes, sans haut débit10 et nécessitent l’ajout de protéines ECM8,10. Cette complexité entraîne également des problèmes de reproductibilité. Une méthode simple et reproductible est nécessaire qui permet la génération d’organoïdes testiculaires avec des cellules-associations qui sont comme le testicule in vivo.
Nous avons récemment signalé un système pour répondre à ces exigences12. En utilisant le porc comme modèle, nous avons utilisé une approche centrifuge d’agrégation forcée dans le système de micropuits. Dans le système de micropuits, chaque puits contient un grand nombre de micropuits identiques plus petits13. Cela permet la génération de nombreux sphéroïdes de taille uniforme. Le système de micropuits a permis la génération d’un grand nombre d’organoïdes uniformes avec une architecture spécifique aux testis. Le système est simple et ne nécessite pas l’ajout de protéines ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons établi une méthode simple qui permet la génération cohérente et reproductible d’un grand nombre d’organoïdes testiculaires avec l’architecture de tissu qui est semblable au testicule in vivo12. Bien que l’approche ait été développée à l’aide de cellules de testicules porcines, elle s’applique plus largement aussi aux testicules de souris, de primates non humains et de testicules humains12. Un certain nombre de méthodes différentes ont été rapporté…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH/NICHD HD091068-01 à la Dre Ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
Referências
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