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Bioengenharia

Synthèse des nanoamas d’or électroluminescents électroluminescents pour les applications biologiques

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

Une méthode fiable et facilement reproductible pour la préparation de neurocomanes d’or photoluminescents fonctionnables et de leur détection directe à l’intérieur des cellules HeLa par cytométrie de flux et microscopie confocale de balayage laser est décrite.

Abstract

Au cours de la dernière décennie, les nanoamas d’or fluorescent (AUNC) ont connu une popularité croissante dans les applications biologiques et d’énormes efforts ont été consacrés à leur développement. Dans ce protocole, une méthode récemment développée et facile pour la préparation des AuNC solubles, biocompatibles et colloïde stables ont été décrites en détail. Cette synthèse chimique ascendante à température ambiante fournit des AUNC facilement fonctionnels recouverts d’acide thioctique et de polyéthylène glycol modifié au thiol dans une solution aqueuse. L’approche synthétique ne nécessite ni solvants organiques ni échange de ligands supplémentaires, ni connaissance approfondie de la chimie synthétique pour se reproduire. Les AuNC qui en résultent offrent des acides carboxyliques de surface gratuits, qui peuvent être fonctionnalisés avec diverses molécules biologiques portant un groupe d’amine libre sans nuire aux propriétés photoluminescentes des AuNC. Une procédure rapide et fiable pour la quantification cytométrique de flux et la formation image microscopique confocale de l’absorption d’AuNC par les cellules de HeLa a également été décrite. En raison du grand changement de Stokes, un réglage approprié des filtres dans la cytométrie de débit et la microscopie confocienne est nécessaire pour une détection efficace de la photoluminescence proche infrarouge des AuNC.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, ultrasmall (2 nm) nanoclusters d’or photoluminescents (PL AuNC) ont émergé comme des sondes prometteuses pour la recherche fondamentale et les applications pratiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Leurs nombreuses caractéristiques souhaitables comprennent une photostabilité élevée, des maxima d’émissions de thon, de longues durées de vie d’émission, de grands changements stokes, une faible toxicité, une bonne biocompatibilité, un dégagement rénal et une bioconjugation facile. Les AUCN PL peuvent fournir une photoluminescence du bleu à la région spectrale proche infrarouge (NIR), selon le nombre d’atomes dans l’amas11 et la nature du ligand de surface12. NIR (650-900 nm) les AuCN émettant sont particulièrement prometteurs pour l’imagerie in vitro et in vivo à long terme des cellules et des tissus, car ils offrent un rapport signal-bruit élevé en raison d’un chevauchement minimal avec l’autofluorescence intrinsèque, une dispersion et une absorption plus faibles, et une pénétration élevée des tissus de la lumière NIR13,14.

Ces dernières années, diverses approches qui tirent parti des interactions covalentes Au-S ont été développées pour préparer les AUCN NIR-PL plafonnés à une variété de ligands contenant du thiol13,15,16,17. Pour les applications biomédicales, les AUNC doivent être fonctionnalisés avec un composant biologique pour faciliter les interactions contraignantes. Ainsi, les auNC avec une grande stabilité colloïdale qui sont facilement fonctionnables chez les solvants aqueux sont hautement souhaitables. L’objectif global du protocole actuel est de décrire une préparation précédemment rapportée de18 AuNC avec un groupe d’acide carboxylique fonctionnel sur la surface en employant l’acide thioctic et le polyéthylène glycol (PEG) dans un environnement aqueux en détail et leur conjugaison avec des molécules portant une amine primaire suivant la méthode d’accouplement acide-amine. En raison de la facilité de synthèse et de la haute reproductibilité, ce protocole peut être utilisé et adapté par des chercheurs issus de milieux non chimiques.

L’une des principales exigences pour les applications des AuNC dans la recherche biomédicale est la capacité d’observer et de mesurer les AUNC à l’intérieur des cellules. Parmi les méthodes disponibles pour surveiller l’absorption des nanoparticules par les cellules, la cytométrie des débits (FCM) et la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) offrent des méthodes robustes et à haut débit qui permettent des mesures rapides de l’internalisation des nanomatériaux fluorescents dans un grand nombre de cellules19. Ici, la méthode FCM et CLSM pour la mesure et l’analyse directes des PNC à l’intérieur des cellules, sans avoir besoin de colorants supplémentaires, ont également été présentées.

Protocol

1. Préparation des auNC électroluminescents électroluminescents (1) Ajouter 7,8 mg (37,8 kmol) d’acide thioctique (TA) et 60 ll de 2 M NaOH à 23,4 ml d’eau ultrapure (résistance 18,2 M.cm à 25 oC) et remuer (au moins 1 000 tr/min) jusqu’à ce qu’il se dissout complètement (15-20 min). Pour une dissolution plus rapide de TA, sonicate le mélange. Pour la synthèse, une solution TA fraîchement préparée est recommandée. Ajouter 10,2 L de HAuCl4’3H2O (470 mg/mL) de…

Representative Results

NIR PL AuNCs ont été préparés à partir d’Au3 en présence de TA, puis LE PEG (MW 2 000) a été lié sur la surface d’AuNC pour obtenir 1 suite au flux de travail indiqué à la figure 1. Couplage amidique entre 1 et 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromure fourni 2. Comme prévu, les spectres d’absorption(figure 2a) ont indiqué que les AuCN 1 et 2</stron…

Discussion

Les AuNC émettant du NIR ont été synthétisés à l’aide d’une approche ascendante dans laquelle la solution de précurseur d’or (HAuCl4) a été traitée avec des ligands thiol appropriés, suivis d’une réduction de Au3 . La réduction des ions métalliques dans la solution aqueuse ont tendance à s’agréger et se traduit par de grandes nanoparticules plutôt que des NCs ultrasmall21. Pour préparer les AUCN PL ultrasmall (2 nm), les conditions synthétiques on…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs sont reconnaissants à Alzbeta Magdolenova pour son aide avec la cytométrie du flux. Les auteurs reconnaissent le soutien financier du projet Nr. 18-12533S du GACR. La microscopie a été réalisée au Laboratoire de microscopie confocale et fluorescence cofinancée par le Fonds européen de développement régional et le budget de l’Etat de la République tchèque, projets non. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00/21515, et soutenu par le grand projet tchèque-BioImaging LM2015062.

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
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Gold NanoclustersNear-infrared EmittingPhotoluminescentThiol-functionalized LigandAmine-functionalized LigandBiosensingBio-imagingUltrafiltrationPolyethylene GlycolEDC HCLCell Culture
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Citar este artigo
Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
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