Sintesi di nanocluster d'oro a emissione di infrarossi nel vicino infrarosso per applicazioni biologiche
Summary
Viene descritto un metodo affidabile e facilmente riproducibile per la preparazione di nanocluster in oro fotoluminescenti funzionalmente e quasi infrarossi e il loro rilevamento diretto all’interno delle cellule HeLa mediante citometria di flusso e microscopia a scansione laser confocale.
Abstract
Nell’ultimo decennio, i nanocluster fluorescenti dell’oro (AuNC) hanno visto una crescente popolarità nelle applicazioni biologiche e sono stati dedicati enormi sforzi al loro sviluppo. In questo protocollo, è stato descritto in dettaglio un metodo facile e sviluppato di recente per la preparazione di AuNC solubili in acqua, biocompatibili e colloidalmente stabili nel vicino infrarosso. Questa sintesi chimica dal basso verso l’alto a temperatura ambiente fornisce AuNC facilmente funzionalizzabili, con acido tioctico e glicole di polietilene modificato con tiolo in soluzione acquosa. L’approccio sintetico non richiede né solventi organici né ulteriori scambi di ligandi né un’ampia conoscenza della chimica sintetica da riprodurre. Gli AuNC risultanti offrono acidi carboxillici di superficie gratuiti, che possono essere funzionalizzati con varie molecole biologiche che portano un gruppo di ammine libero senza influire negativamente sulle proprietà fotoluminescenti degli AuNC. È stata inoltre descritta una procedura rapida e affidabile per la quantificazione citometrica del flusso e l’imaging microscopico confocale dell’assorbimento dell’AuNC da parte delle cellule HeLa. A causa del grande spostamento di Stokes, è necessaria una corretta impostazione dei filtri nella citometria di flusso e nella microscopia confocale per rilevare in modo efficiente la fotoluminescenza nel vicino infrarosso degli AuNC.
Introduction
Nell’ultimo decennio, ultrapiccoli nanocluster di oro fotoluminescenti (PL AuNC) sono emersi come sonde promettenti sia per la ricerca fondamentale che per le applicazioni pratiche1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.2 Le loro molteplici caratteristiche sono l’elevata fotostabilità, la massima le emissioni regolabili, le lunghe emissioni di durata, i grandi spostamenti di Stokes, la bassa tossicità, la buona biocompatibilità, la clearance renale e la facile bioconcentrazione. PL AuNC è in grado di fornire la fotoluminescenza dalla regione spettrale blu a quella del vicino infrarosso (NIR), a seconda del numero di atomi all’interno del cluster11 e della natura del ligando superficiale12. Le schede di interfaccia di rete (650-900 nm) che emettono AuNC sono particolarmente promettenti per l’imaging a lungo termine in vitro e in vivo di cellule e tessuti, in quanto offrono un elevato rapporto segnale-rumore a causa della minima sovrapposizione con l’autofluorescenza intrinseca a dispersione, l’indebolimento e l’assorbimento e un’elevata penetrazione dei tessuti della luce NIR13,14.
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati vari approcci che sfruttano le interazioni covalenti Au-S per preparare NIR-PL AuNCC limitato con una varietà di ligandi contenenti thiol13,15,16,17. Per applicazioni biomediche, le AuNC devono essere funzionalizzate con una componente biologica per facilitare le interazioni di legame. Pertanto, gli AuNC ad alta stabilità colloidale che sono facilmente funzionalizzabili in un solvente acquoso sono altamente desiderabili. L’obiettivo generale dell’attuale protocollo è quello di descrivere una precedente preparazione di18 AuNC con un gruppo di acido carboxillico funzionalizzabile sulla superficie utilizzando acido tiottico e glicole di polietilene (PEG) in un ambiente acquoso in dettaglio e la loro coniugazione con molecole che portano un ammine primario seguendo il metodo di accoppiamento acido-amine. A causa della facilità di sintesi e dell’elevata riproducibilità, questo protocollo può essere utilizzato e adattato dai ricercatori provenienti da contesti non chimici.
Uno dei requisiti chiave per l’applicazione delle AuNC nella ricerca biomedica è la capacità di osservare e misurare gli acchi all’interno delle cellule. Tra i metodi disponibili per monitorare l’assorbimento delle nanoparticelle da parte delle cellule, la citometria di flusso (FCM) e la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) offrono metodi robusti e ad alta produttività che consentono misurazioni rapide dell’internalizzazione dei nanomateriali fluorescenti in un gran numero di cellule19. Qui, è stato presentato anche il metodo FCM e CLSM per la misurazione diretta e l’analisi delle PL AuNC all’interno delle cellule, senza la necessità di coloranti aggiuntivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli AuNC che emettono NIR sono stati sintetizzati utilizzando un approccio bottom-up in cui la soluzione precursore dell’oro (HAuCl4) è stata trattata con ligandi tioli adatti, seguiti dalla riduzione di Au3. La riduzione degli ioni metallici in soluzione acquosa tende ad aggregarsi e si traduce in nanoparticelle di grandi dimensioni piuttosto che in NC ultrapiccoli21. Per preparare gli AuNC PL ultrapiccoli (2 nm), le condizioni sintetiche sono state regolate per prevenire l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati ad Alzbeta Magdolenova per il suo aiuto con la citometria di flusso. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del progetto GACR Nr. 18-12533S. La microscopia è stata effettuata nel Laboratorio di microscopia confocale e fluorescenza cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale e dal bilancio statale della Repubblica ceca, i progetti no. C’.1.05/4.1.00/16.0347 e C’.2.16/3.1.00/21515 e supportati dal progetto RI di grandi dimensioni Ceco-BioImaging LM2015062.
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
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