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Bioengenharia

Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

Se describe un método fiable y fácilmente reproducible para la preparación de nanocúmulos de oro fotoluminiscente de emisión de infrarrojo cercano funcional y y su detección directa dentro de las células de HeLa mediante citometría de flujo y microscopía de escaneo láser confocal.

Abstract

Durante la última década, los nanoclusters de oro fluorescente (AuNCs) han sido testigos de una creciente popularidad en aplicaciones biológicas y se han dedicado enormes esfuerzos a su desarrollo. En este protocolo, se ha descrito en detalle un método fácil recientemente desarrollado para la preparación de AuNCs de emisión de infrarrojo cercano solubles en agua, biocompatibles y coloidialmente estables. Esta síntesis química de temperatura ambiente y de abajo hacia arriba proporciona ACN fácilmente funcionalizables tapados con ácido tiotable y polietilenglicol modificado con tio en solución acuosa. El enfoque sintético no requiere disolventes orgánicos ni intercambio de ligandos adicionales ni un amplio conocimiento de la química sintética para reproducirse. Los AuNC resultantes ofrecen ácidos carboxílicos de superficie libre, que se pueden funcionalizar con varias moléculas biológicas que llevan un grupo libre de aminas sin afectar negativamente a las propiedades fotoluminiscentes de los ACN. También se describió un procedimiento rápido y fiable para la cuantificación citométrica de flujo y la toma microscópica confocal de la toma de AuNC por las células de HeLa. Debido al gran cambio de Stokes, es necesario ajustar adecuadamente los filtros en la citometría de flujo y la microscopía confocal para la detección eficiente de fotoluminiscencia de infrarrojo cercano de los ACN.

Introduction

En la última década, nanoclusters de oro fotoluminiscente ultrapequeños (2 nm) han surgido como sondas prometedoras tanto para la investigación fundamental como para aplicaciones prácticas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Sus muchas características deseables incluyen alta fotoestabilidad, máxima de emisión ajustable, largos ciclo de emisión, grandes cambios Stokes, baja toxicidad, buena biocompatibilidad, aclaramiento renal y bioconjugación fácil. Los AuNC PL pueden proporcionar fotoluminiscencia desde el azul hasta la región espectral de infrarrojo cercano (NIR), dependiendo del número de átomos dentro del cluster11 y la naturaleza del ligando superficial12. Los ANAC emisores de NIR (650-900 nm) son particularmente prometedores para las imágenes in vitro e in vivo a largo plazo de células y tejidos, ya que ofrecen una alta relación señal-ruido debido a una mínima superposición con autofluorescencia intrínseca, dispersión y absorción más débiles y alta penetración de tejido de la luz NIR13,14.

En los últimos años, se han desarrollado diversos enfoques que aprovechan las interacciones covalentes de Au-S para preparar Los ACN NIR-PL tapados con una variedad de ligandos que contienen tiol13,,15,,16,,17. Para aplicaciones biomédicas, los ACN deben ser funcionalizados con un componente biológico para facilitar las interacciones vinculantes. Por lo tanto, los AuNCs con alta estabilidad coloidal que son fácilmente funcionalizables en disolvente acuoso son altamente deseables. El objetivo general del protocolo actual es describir una preparación previamente notificada deLos AuNC con un grupo de ácido carboxílico funcionalizable en la superficie mediante el uso de ácido tiojal y polietilenglicol (PEG) en un entorno acuoso en detalle y su conjugación con moléculas que llevan una amina primaria siguiendo el método de acoplamiento ácido-amina. Debido a la facilidad de síntesis y alta reproducibilidad, este protocolo puede ser utilizado y adaptado por investigadores de orígenes no químicos.

Uno de los requisitos clave para las aplicaciones de los ACN en la investigación biomédica es la capacidad de observar y medir los ACN dentro de las células. Entre los métodos disponibles para monitorear la absorción de nanopartículas por células, la citometría de flujo (FCM) y la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) ofrecen métodos robustos y de alto rendimiento que permiten mediciones rápidas de la internalización de nanomateriales fluorescentes en un gran número de células19. Aquí, el método FCM y CLSM para la medición directa y el análisis de los AuNC PL dentro de las células, sin la necesidad de disteantes adicionales, también se han presentado.

Protocol

1. Preparación de ACN emisores de infrarrojo cercano (1) Añadir 7,8 mg (37,8 m) de ácido tiojal (TA) y 60 ml de NaOH de 2 M a 23,4 ml de agua ultrapura (resistividad de 18,2 M a 25 oC) y agitar (al menos 1.000 rpm) hasta que se disuelva por completo (15-20 min). Para una disolución más rápida de TA, sonicar la mezcla. Para la síntesis, se recomienda la solución TA recién preparada. Añadir 10,2 ml de HAuCl4x 3H2O (470 mg/ml) de solución acuosa a la solución. …

Representative Results

Los AuNC NIR PL se prepararon a partir de Au3+ en presencia de TA, y luego PEG terminado tiol (MW 2.000) se asolidó en la superficie AuNC para obtener 1 siguiendo el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 1. Acoplamiento amida entre 1 y 3-(aminopropyl) bromuro de trifenilffosfano (TPP) proporcionado 2. Como era de esperar, los espectros de absorción(Figura 2a) indicaron que los ACN 1</…

Discussion

Los AuNc emisores de NIR se sintetizaron utilizando un enfoque de abajo hacia arriba en el que la solución precursora de oro (HAuCl4) fue tratada con ligandos tiol adecuados, seguido de una reducción de Au3+. La reducción de los iones metálicos en la solución acuosa tiende a agregar y da como resultado nanopartículas grandes en lugar de NCs ultrapequeños21. Para preparar AuNCs PL ultrapequeños (2 nm), se ajustaron las condiciones sintéticas para evitar la formación …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores están agradecidos a Alzbeta Magdolenova por su ayuda con la citometría de flujo. Los autores reconocen el apoyo financiero del proyecto GACR Nr. 18-12533S. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y Fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa, proyectos no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515, y con el apoyo del proyecto de ri2015062 de ri grande Checo-BioImaging.

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
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Keywords: Gold NanoclustersNear-infrared EmittingPhotoluminescentThiol-functionalized LigandAmine-functionalized LigandBiosensingBio-imagingUltrafiltrationPolyethylene GlycolEDC HCLCell Culture
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Citar este artigo
Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
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