Native polyakrylamid gel elektroforese Immunoblot analyse av endogene IRF5 Dimerization
Summary
En innfødt Western Blot metode for å analysere endogene interferon regulatoriske faktor 5 dimerization i CAL-1 plasmacytoid dendrittiske cellelinjen er beskrevet. Denne protokollen kan også brukes på andre cellelinjer.
Abstract
Interferon regulerings faktor 5 (IRF5) er en nøkkel transkripsjon faktor for å regulere immunresponsen. Det er aktivert nedstrøms av toll-lignende reseptor myelogen differensiering primære respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering veien. IRF5 aktivering innebærer fosforylering, dimerization, og påfølgende translokasjon fra cytoplasma inn i kjernen, som igjen induserer genet uttrykk for ulike Pro-inflammatorisk cytokiner. En deteksjon analysen for IRF5 aktivering er viktig å studere IRF5 funksjoner og relevante veier. Denne artikkelen beskriver en robust analysen til å oppdage endogene IRF5 aktivering i CAL-1 Human plasmacytoid dendrittiske celle (pDC) linje. Protokollen består av en modifisert nondenaturing elektroforese analysen det kanne skjelne IRF5 i sin monomer og dimer blankett, således skaffer en affordable og følsom adgang å analysere IRF5 aktivisering.
Introduction
Interferon regulatoriske faktor 5 (IRF5) er en viktig transkripsjon regulator som spiller en fremtredende rolle i å regulere immunresponsen, spesielt i utgivelsen av Pro-inflammatorisk cytokiner og type I interferoner (IFNs)1,2 ,3. Misregulation av IRF5 er en medvirkende faktor i mange autoimmune sykdommer, som tydelig av ulike polymorfismer i IRF5 geometriske steder som er forbundet med systemisk lupus erythematosus, multippel sklerose, revmatoid artritt, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Derfor, en robust oppdagelsen analysen for endogene IRF5 aktivisering begrunne er avgjørende for forståelse det regulere trasé og nedstrøms virkninger av IRF5 inne en fysiologisk relevant Cellular sammenheng.
IRF5 er constitutively uttrykt i monocytter, dendrittiske celler (DCs), B-celler og makrofager1,11. Som med andre IRF familien transkripsjon faktorer, IRF5 bor i cytoplasma i sin latente tilstand. Ved aktivering, IRF5 er fosforylert og danner homodimers, som deretter translocate inn i kjernen og binder seg til spesifikke regulatoriske elementer av gener koding type jeg IFNs og Pro-inflammatorisk cytokiner, til slutt indusere uttrykk for disse genene1 ,2,11,12,13. IRF5 regulerer medfødte immunresponser nedstrøms av ulike bompenger-lignende reseptorer (TLRs), slik som TLR7, TLR 8, og TLR 9, som er lokalisert i endosomes og bruke MyD88 for signalnettverk1,11,14. Disse TLRs anerkjenner først og fremst utenlandske nukleinsyre yre arter som single-strandet RNA (ssRNA) og metylerte CpG DNA som er symptomatisk for en infeksjon15,16,17,18. IRF5 har vist å regulere immunresponser mot bakteriell, viral, og fungal infeksjoner19,20,21. Vurderer IRF5’s innflytelsesrike og mangfoldig rolle i immunforsvaret, styrke eller dempe IRF5 aktivitet kan tjene som en roman Avenue for utvikling av terapeutiske agenter22. Derfor er det avgjørende å utvikle en protokoll for å overvåke aktiveringsstatus endogene IRF5 å tillate grundig undersøkelse av veier og mekanismer som regulerer IRF5 aktivitet i ulike celletyper.
Etter beste av vår kunnskap, ingen biokjemiske eller gel Elektroforetiske analysen for endogene IRF5 aktivisering har blitt publisert før utviklingen av denne protokollen. Fosforylering har vist seg å være et viktig første trinn i IRF5-aktiveringen, og et phosphospecific IRF5-antistoff ble utviklet som førte til oppdagelsen og bekreftelsen av en Serine rester som var viktig for IRF5 aktivitet13. Men mens antistoff klart oppdager fosforylert IRF5 når immunoprecipitated eller overexpressed23, den ikke klarer å oppdage IRF5 fosforylering i en hel celle lysat i våre hender (data ikke vist). Dimerization er neste trinn i IRF5 aktivisering, og mange viktige studier til dato gransker dette trinnet var avhengig av overuttrykte av epitope-Tagged IRF5, ofte i irrelevante celletyper som ikke normalt uttrykker IRF511,12 ,24,25. Tidligere studier har vist at dimerized IRF5 kan ikke alltid translocate inn i kjernen og dermed er ikke nødvendigvis fullt aktivert25,26. En analysen for endogene IRF5 kjernefysiske lokalisering ble utviklet for å vurdere IRF5 aktivering av Imaging Flow flowcytometri27. Denne analysen har vært brukt i studier som var avgjørende for å forstå IRF5 aktivitet, spesielt i primære eller sjeldne celletyper28,29 og i stor grad avanserte kunnskapen i feltet. Imidlertid er denne analysen avhengig av et spesialisert instrument som ikke er allment tilgjengelig for forskere. Videre er det ofte nødvendig å undersøke de innledende trinnene for aktivisering mens dissekere IRF5 regulatoriske trasé og identifisere oppstrøms regulatorer og Pathway komponenter. Denne studien gir en robust og pålitelig biokjemiske analysen for tidlig aktivering hendelser av IRF5 som kan utføres i laboratorier utstyrt med molekylærbiologi verktøy. Protokollen som er beskrevet her vil være svært nyttig i å undersøke veier og mekanismer for IRF5 handlinger, spesielt når kombinert med ortogonale analyser som Imaging Flow analytiske analyse av IRF5 kjernefysiske lokalisering23, 27,28,30.
Native polyakrylamid gel elektroforese (Native side) er en mye brukt metode for å analysere protein komplekser31,32. I motsetning til natrium dodecylsulfate polyakrylamid gel-elektroforese (SDS-PAGE), skiller den innfødte siden proteiner på grunnlag av sin form, størrelse og ladning. Den beholder også native protein struktur uten denaturering31,33,34,35. Protokollen forevist utnytter disse vise egenskaper av innfødt side og merker begge to monomere og dimeric blankett av IRF5. Denne metoden er spesielt viktig for å oppdage tidlige aktiverings hendelser fordi det ikke er egnet kommersielt tilgjengelig antistoff som kan oppdage endogene fosforylert IRF5. Tidligere brukte flere publiserte studier native PAGE for å vurdere IRF5 dimerization. Men de fleste av disse studiene var avhengig av overuttrykte av eksogene epitope-merket IRF5 å analysere aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Dette arbeidet presenterer en steg-for-trinn protokoll for å analysere endogene IRF5 dimerization via en modifisert native PAGE teknikk i en menneskelig plasmacytoid dendrittiske celle (pDC) linje, der IRF5 aktivitet har vist seg å være avgjørende for sin funksjon1, 38,39,40. Den samme teknikken har blitt brukt på andre cellelinjer23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som er beskrevet her er en modifisert innfødt side som skiller både monomere og dimeric former for endogene IRF5. Det har vært få studier som rapporterer påvisning av endogene IRF5 aktivering ved hjelp av spesialiserte Imaging Flow flowcytometri Technique23,27,28,30. Denne protokollen bruker en felles teknikk og vanlig reagenser og verktøy for å vurdere den endogene IRF5 akti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av finansiering fra Croucher Foundation og City University oppstart midler. Vi takker alle medlemmer av Chow laboratoriet for hjelp med eksperimentet og kritisk lesning av manuskriptet.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
Referências
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. Bioquímica. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
