Um método ocidental nativo do borrão para analisar o dimerização regulador endógeno do fator 5 do interferon na linha de pilha dendríticas do plasmacytoid Cal-1 é descrito. Este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de célula também.
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Artigo de método
Análise imunoblot da electroforese do gel do polyacrylamide nativo da dimerization IRF5 endógena
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fator regulador 5 do interferon (IRF5) é um fator chave da transcrição para regular a resposta imune. É ativado a jusante da via de sinalização do gene de resposta primária 88 (TLR-MyD88) da diferenciação Myeloid do receptor Toll-like. A ativação do IRF5 envolve a fosforilação, a dimerização e a subsequente translocação do citoplasma para o núcleo, que por sua vez induz a expressão gênica de várias citocinas pró-inflamatórias. Um ensaio de detecção para ativação IRF5 é essencial para estudar funções IRF5 e seus caminhos relevantes. Este artigo descreve um ensaio robusto para detectar a ativação IRF5 endógena na linha de célula dendrítica do plasmacytoid humano de CAL-1 (pDC). O protocolo consiste em um ensaio de eletroforese não desnaturante modificado que pode distinguir IRF5 em suas formas de monómero e dímero, proporcionando assim uma abordagem acessível e sensível para analisar a ativação do IRF5.
Introdução
O fator de regulação do interferão 5 (IRF5) é um importante regulador de transcrição que desempenha um papel proeminente na regulação da resposta imune, particularmente na liberação de citocinas pró-inflamatórias e interferões tipo I (ifns)1,2 ,3. A desregulação do IRF5 é um fator contribuinte em inúmeras doenças auto-imunes, como evidente por vários polimorfismos no locus IRF5 que estão associados com lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, artrite reumatóide, etc.4, 5,6
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Protocolo
Nota: O protocolo descrito aqui utiliza a linha de célula pDC de CAL-1 tratada com resiquimod (R848), um agonista para TLR7/8. Este protocolo foi aplicado a outros tipos de células humanas e murinas, incluindo RAW 264,7 (linha de macrófago murino), THP-1 (linha celular monocítica humana), BJAB (linha celular B humana), ramos (linha celular B humana) e MUTZ-3 (linha celular dendrítica humana)23.
1. estimulação das células CAL-1
- Manter culturas de células CAL-1 em um balão de T75 a 37 ° c e 5% CO2 em condições estéreis com 20 − 25 ml de meio rpmi 1640 contendo 5% de soro bovino FET....
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Resultados
O immunoblot (IB) com um anticorpo IRF5 foi executado em pilhas de CAL-1 não estimuladas ou estimulado com 1 μg/mL R848 para 2 h (Figura 1). Os lysates da pilha foram preparados, e o nativo PAGE foi executado. Em células CAL-1 não estimuladas, o IRF5 foi detectado como uma única banda na página nativa, correspondendo à sua forma monomérica. Em cima do tratamento de pilhas de cal-1 com R848 para 2 h, o nível do monômero IRF5 diminuiu com um aumento simultâneo na acumulação de uma faixa lentam.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui é uma página nativa modificada que distingue formas monoméricas e diméricas de IRF5 endógenas. Há poucos estudos relatando a detecção da ativação endógena de IRF5 utilizando a técnica de citometria de fluxo de imagem especializada23,27,28,30. Este protocolo usa uma técnica comum e reagentes e ferramentas comuns para avaliar o estado de ativação IRF5 endógena durante os.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O trabalho foi apoiado pelo financiamento dos fundos de arranque da Fundação Croucher e da City University. Agradecemos a todos os membros do laboratório Chow por ajuda com o experimento e leitura crítica do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Life Technologies, fonte | HK 21985023 | |
| 300 W/250 V 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anticorpo anti-IRF5 | Bethyl Laboratories, EUA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (seguro para câmaras frigoríficas) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL | Life Technologies | ||
| Glicerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Cabra anti-camundongo IgG DyLight 800 Anticorpo conjugado | LAB-A-PORTER / Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Cabra anti-coelho IgG DyLight 800 Anticorpo conjugado | LAB-A-PORTER / Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Coquetel de inibidor de protease de parada (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Módulo de transferência, acessórios | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% géis, kit de 10 poços | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/ Calbiochem, HK | # 492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) | Bio-gene / Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Kit de ensaio de proteína II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | ||
| Cloreto de Sódio | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Desoxicolato de Sódio ≥ 97% (titulação) | Hang da lata/Sigma, tecnologias | D6750-100G | |
| Tris | , suspensão | HK 15504020 | |
| TWEEN 20 | Sigma, HK | #P9416-100ML |
Referências
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that....
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Reimpressões e permissões
