Este artigo descreve um método de transplante para enxertar células epiteliais mamárias doadoras na almofada de gordura branca interscapular de animais receptores. Este método pode ser usado para examinar os efeitos do hospedeiro e/ou doador no desenvolvimento do epitélio mamário e elimina a necessidade de pré-compensação, estendendo assim a utilidade desta técnica.
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Artigo de método
Transplante de células epiteliais mamárias no Bloco de Gordura Branca Interscapular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Já na década de 1970, pesquisadores transplantaram com sucesso células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos. Enxerto de epitélio mamário usando técnicas de transplante aproveita o ambiente hormonal fornecido pelo hospedeiro adolescente roedor. Esses estudos são idealmente adequados para explorar o impacto de várias manipulações biológicas no desenvolvimento da glândula mamária e dissecam muitos aspectos da biologia da glândula mamária. Uma característica comum, mas limitante, é que as células epiteliais transplantadas são fortemente influenciadas pelo estroma circundante e superadas pelo epitélio endógeno; para utilizar tecido mamário nativo, a almofada de gordura branca abdominais deve ser liberada para remover o epitélio mamário hospedeiro antes do transplante. Um grande obstáculo ao usar o organismo modelo de rato é que limpar a árvore mamária em desenvolvimento em ratos pós-desacidos não é eficiente. Quando transplantadas em almofadas de gordura sem glândulas, as células epiteliais doadora podem repovoar o bloco de gordura de hospedeiro limpo e formar uma glândula mamária funcional. O bloco de gordura interscapular é um local alternativo para esses enxertos. Uma grande vantagem é que ele carece de estruturas ductais, mas fornece o estroma normal necessário para promover o crescimento epitelial e é facilmente acessível no rato. Outra grande vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva, pois elimina a necessidade de cauterizar e remover a crescente árvore mamária endógena. Além disso, a almofada de gordura interscapular contém um vaso sanguíneo medial que pode ser usado para separar locais para enxerto. Como as glândulas endógenas permanecem intactas, essa técnica também pode ser usada para estudos comparando a glândula mamária endógena à glândula transplantada. Este artigo descreve o método de transplante de células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos.
Introdução
O desenvolvimento da glândula mamária pós-natal e a morfogênese ductal são processos em grande parte influenciados pela sinalização hormonal no início da puberdade. Em camundongos e ratos, comumente utilizados organismos modelo saem da biologia da glândula mamária, esse processo começa por volta de 3 semanas de idade, onde a rápida proliferação e diferenciação resultam na formação do parenchyma maduro. A glândula mamária madura pode passar por inúmeras rodadas de expansão e involução, uma propriedade que está investigação desde o início do séculoXX. No contexto de hiperproliferação e desenvolvimento do câncer, foramdesenvolvidastécni....
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Protocolo
Todos os animais foram alojados e mantidos em uma instalação aprovada pela AAALAC, e experimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do MUSC (IACUC). Os animais para uso em transplante recíproco devem ser uma cepa intérmata ou isogênica, com status congênico preferido ou recuado por pelo menos 6 gerações.
1. Colheita do doador de mammary glândula epitélio
- Determine o número de ratos doadores necessários para transplante.
NOTA: Geralmente, 1 rato doador (4 semanas de idade) pode fornecer células suficientes para transplante em 4 animais receptores. Certas aplicações d....
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Resultados
Doadores e receptores mammary glândulas
As etapas para isolar e preparar células epiteliais mamárias de ratos para transplante são mostradas na Figura 1A. Com 4 semanas de idade, a glândula mamária endógena do rato doador começou a amadurecer e o epitélio pode ser visualizado em slides inteiros montados manchados com carmina alum(Figura 1B). Um rat.......
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Discussão
Este protocolo descreve uma técnica de transplante de células epiteliais mamáriaotimizada para trabalhar com ratos. Organoides epiteliais mamários isolados de ratos doadores (3-5 semanas de idade) são enxertados na almofada de gordura branca interscapular de ratos receptores (também de 3 a 5 semanas de idade). Os resultados podem ser interpretados apenas 4-6 semanas depois, usando microscopia leve para examinar o tecido enxertado; no entanto, a quantidade ideal de tempo entre transplante e sacrifício deve ser determinada.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Apoio ao Câncer do Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 financiamento de pesquisa piloto dos Institutos Nacionais de Saúde (https://www.nih.gov/),e recursos do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade Médica da Carolina do Sul. Gostaríamos de agradecer marijne Smiths por gravar as declarações da entrevista.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ Filtros de seringa M | Fisher Scientific | 09-715G | meio de digestão de colagenase com filtragem estéril |
| 1.5 - 2.0 mL tubos de microcentrífuga (estéreis) | Fisher Scientific | 05-408-129 | contendo células ressuspensas e/ou mistura de homogeneizado cerebral |
| 100 µ Filtros de células M | Corning | 431752 | homogeneizado cerebral filtrante |
| Seringas estanques a gás de 100 uL com agulhas de calibre 25 | Hamilton | 81001 e 90525 | Para injetar mistura de enxerto em animais receptores (1 por genótipo/condição do doador) |
| pontas de pipeta de 1000 uL + pipeta | - | de | células/misturas/tecido |
| Tubo de polipropileno de 15 mL | Falcon (Corning) | 352196 | armazenamento de mistura homogeneizada cerebral, ou célula: mistura homogeneizada para transplante |
| 40 µ Filtros de células M | Corning | 431750 | organoides filtrantes após a lavagem do pellet celular |
| Tubos de polipropileno de 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-6 | para digestão de colagenase de tecido de glândula mamária doadora |
| Placas de 60 mm | Thermo Scientific | 130181 | para picar tecido |
| Sulfato de potássio de alúmen | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | coloração de glândula mamária montagem inteira slides |
| Vaporizador de anestesia para uso veterinário | - | siga o protocolo institucional | |
| Beta-dine ou iodo | - | ||
| Tubo de cultura de vidro borossilicato para homogeneização | Fisher Scientific | 14-961-26 | para homogeneização do cérebro (use tubo apropriado para homogeneizador) |
| Carmim | Sigma-Aldrich | C6152 / 1022 | coloração glândula mamária lâminas de montagem inteira |
| Aparelho de contagem de células | - | ||
| Gaiolas de animais limpas para recuperação | - | siga o protocolo institucional | |
| Colagenase Tipo 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | digestão enzimática de tecido de glândula mamária picado de ratos doadores |
| água deionizada | - | para soluções químicas | |
| DMEM / F12 | GIBCO | 11320033 | para picar tecido, meios de digestão de colagenase e ressuspensão de misturas de células epiteliais |
| EDTA | - | mistura de monodispersão | |
| Etanol, 200 Prova | Decon Labs | 2705/2701 | fixador de lâmina de montagem inteira mamária, lavagens de corrediça de montagem inteira mamária, limpeza de locais de incisão cirúrgica (diluída) Soro |
| fetal (FBS) | de | inativação | Hyclone |
| - | |||
| Ácido acético glacial | Fisher Scientific | A38-212 | uso para fixador de lâmina de montagem inteira mamária (ácido acético glacial 1: 4 em 100% etanol) |
| HBSS | GIBCO | - | mistura de monodispersão |
| Almofadas de aquecimento | - | - | siga o protocolo institucional |
| Baldes de gelo (x2) | - | - | |
| Incubadora com rotação orbital | - | -deve ser capaz de manter 37&graus; C, agitando a 220-225 RPM (para digestão de colagenase do tecido mamário) | |
| Anestesia com isoflurano | - | siga o protocolo institucional | |
| Microscópio óptico ou câmera digital | - | visualizando todo o epitélio mamário montado e / ou adquirindo imagens | |
| Homogeneizador mecânico | Fisher Scientific-TissueMiser | ou modelos alternativos | |
| Óleo mineral, puro | Sigma-Aldrich / ACROS Organics | 8042-47-5 | armazenamento de longo prazo de montagens inteiras de glândula mamária limpa |
| Tanques de oxigênio para vaporizador | de | - | siga o protocolo institucional |
| Toalhas de papel ou lenços de tarefas delicadas | - | ||
| Lâminas de microscópio carregadas positivamente Montagens | inteiras de tecido de glândula mamária | Thermo Scientific | P4981-001 |
| Pós-operatório analgésico | - | Protocolo institucional | |
| Medidas | de peso corporal da | ||
| Barbeador | - | cortadores elétricos ou outros | |
| frascos de coloração | - | mínimo de 1 por lavagem química, tamanho apropriado para o número de lâminas, vidro preferido | |
| Cortinas de campo estéreis | IMCO | 4410-IMC | usado durante o |
| transplante Tesouras e fórceps estéreis x3 (autoclavados) | - | - | ferramentas cirúrgicas de autoclave usadas para doadores e receptores |
| Seringas: 5 mL (ou mais) | - | - | para filtração estéril de meios de digestão de colagenase |
| Mistura de monodispersão | tripsina | Worthington | |
| Receptáculo de coleta de resíduos para líquidos (derramado ou aspirado) | - | - | |
| Aplicador de clipe de ferida, clipes e ferramenta de remoção | Ferramentas de Fine Science | 12020-00 | Fechando a incisão na pele sobre a almofada branca interescapular |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | limpando a glândula mamária inteira desliza após a coloração |
Referências
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H.
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Reimpressões e permissões
