間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

Summary

本稿では、レシピエント動物の間肩甲膜白色脂肪パッドにドナーラット乳腺上皮細胞を移植する移植方法について説明する。この方法は、乳腺上皮発生に対する宿主および/またはドナーの影響を調べるために使用することができ、事前にクリアする必要がなくなり、この技術の有用性を拡張する。

Abstract

早くも1970年代に、研究者は乳腺上皮細胞をラットの肩甲膜間白い脂肪パッドに移植しました。移植技術を用いた乳腺上皮移植は、思春期のげっ歯類宿主が提供するホルモン環境を利用する。これらの研究は、様々な生物学的操作が乳腺の発達に及ぼす影響を探求し、乳腺生物学の多くの側面を解剖するのに理想的である。一般的な、しかし制限的な特徴は、移植された上皮細胞が周囲の間質によって強く影響され、内因性上皮によって競争されるということです。ネイティブの乳腺組織を利用するには、移植前に宿主乳腺上皮を除去するために腹部の、うろたえの白い脂肪パッドをクリアする必要があります。ラットモデル生物を使用する際の大きな障害は、後産ラットで発達中の乳腺の木を取り除くのが効率的ではないということです。腺のない脂肪パッドに移植すると、ドナー上皮細胞は、クリアされた宿主脂肪パッドを再移植し、機能的な乳腺を形成することができる。間肩甲膜脂肪パッドは、これらの移植片のための代替位置です。主な利点は、それがまだ上皮の成長を促進するために必要であり、ラットで容易にアクセス可能である正常な間質を提供する導管構造を欠いているということです。この技術のもう一つの大きな利点は、それが焼灼し、成長する内因性乳腺の木を除去する必要性を排除するので、それは、最小限の侵襲性であるということです。さらに、中小肩甲膜脂肪パッドは、移植のための部位を分離するために使用することができる内側血管を含む。内因性腺はそのまま残るため、この技術は、内因性乳腺と移植された腺を比較する研究にも使用できます。本論文はラットの間肩甲膜白色脂肪パッドへの乳腺上皮細胞移植法について述べている。

Introduction

出生後の乳腺の発生および乳管形態形成は、主に思春期の発症時のホルモンシグナル伝達の影響を受けるプロセスである。乳腺生物学の一般的に使用されるモデル生物であるマウスおよびラットでは、このプロセスは約3週齢から始まり、急速な増殖と分化が成熟したパレンチマの形成をもたらす。成熟した乳腺は、20^世紀初頭から調査中の拡張とインボル化の多数のラウンドを受けることができます。過剰増殖と癌の発症の文脈の中で、乳腺移植技術は1950年代¹に開発され、1977^年2、3、4年にGouldらによって寄与された定量的方法論によって増強された。げっ歯類の移植技術の改良は、正常な乳腺の発達および疾患状態に対する様々な治療および遺伝子操作の効果を研究するためにまだ広く使用されている正常な乳腺生物学を理解する上で大きな進歩に貢献している。

多くの仮説が生成され、その後、乳腺移植を使用してテスト^{されています,}最初にDeOmeらによって記述されました 1 . 1.数十年にわたる実験は、ドナー乳腺から切除された乳腺の切断の傾向を示し、脂肪パッド^5、6、7全体を再移植し、乳腺発達の重要な成分がこれらの上皮構造に存在することを示した。マウスの後の研究は、単一の乳腺幹細胞がクリアされた脂肪パッドを再取り込みできることを示し、^基底および明尿乳上皮細胞^8、9、10の単一の共通の前駆細胞の発見に寄与した。これらの結論に沿って、移植は可塑性の結果として多系統的に再人口化する可能性を有する細胞のプールを増加させ、移植された細胞が機能的な乳腺^{7、10、11、12、13}を成長させることが示唆されている。重要なことに、げっ歯類における移植技術の使用は、細胞培養誘発異常¹⁴の限界を克服し、多くの場合、わずか数週間で結果を提供する。

この処置はもともとマウスの前生性病変の文脈で説明されていたが、すぐにラットに拡大され、癌感受性¹⁵の尺度として多重性を確立するために発がん性治療と組み合わせて使用されたが、移植技術の人気は各種の遺伝的ツールの開発に続いている。移植を組み込んだマウス研究は多くの翻訳所見を占めているが、ラット乳腺のまん性はヒトに似ている^16,17で、エストロゲン受容体陽性(ER+)乳癌を研究する上で明確な利点を提供する。乳腺腫瘍は両方の種で誘導可能であるが、それらはホルモン感受性および遺伝子発現プロファイルの点で異なる。主な違いは、ラット乳腺腫瘍が、ヒト乳癌の発光A亜型と同様に、卵巣および下垂体ホルモン受容体、すなわちエストロゲンおよびプロゲステロン(PR)の機能を発現し、依存することである。実際、乳腺上皮細胞移植は、このプロトコルに記載されているように、乳癌に関与する遺伝的変異体を研究し、乳腺上皮細胞¹⁸に及ぼす効果の細胞自律性を決定するために使用されている。

腫瘍生物学に加えて、正常ラット乳腺の管上皮は、より高いレベルの分岐を示し、マウスよりも深い間質層によって横たわっている。間質の重要性は、乳腺上皮移植研究において十分に文書化されている。乳腺上皮は脂肪間質と相互作用しなければならず、理想的には、その特徴的な形態形成^19、20を受けるために、それ自身の間感覚と相互作用しなければならない。レシピエント乳腺に組織を移植することは最適な環境を提供します。しかし、内因性上皮の存在は結果を妨げる可能性があります。内因性上皮の乳腺を事前にクリアすることは、マウス移植アッセイで一般的に行われ、内因性乳腺組織の外科的切除および/または乳頭^1、21、22の除去を必要とする。可能であるが、後の乳腺の前皮を前取りするラットは、主に後乳枝ラットの成長する乳腺の木を取り除く効果がないため、それほど広く行われない。体の他の場所で脂肪組織の領域が移植乳上皮21、23、24の成長を支えることができることが示されているので、プリクリアリングのプロセスは、組織を中小体白脂肪パッドに移植することによってラットで容易に回避することができる。

本論文に記載された移植方法は、酵素的に解ソシエアされた乳腺オルガノイド(乳管上皮および形態形成が可能な他の細胞タイプの断片)または単分散細胞を近交交型の間帯脂肪パッドに注射することを含む、実験室ラット²の間蓋脂肪パッドへの単分散性株。間肩甲膜脂肪パッドは通常乳腺組織を欠いているため、内因性上皮を事前に透明にする必要なしに、複数の移植部位に適した環境を提供する。その結果、宿主動物の内因性、腹部を肛門の乳腺は外科的操作の対象とならず、正常に発達し、結果の解釈を妨げることはできない。さらに、無傷の乳腺は、乳腺上皮発生および腫瘍形成^18、25に対する宿主対ドナー効果を評価するための比較に使用することができる。単一幹細胞からの乳腺の再集団化はマウスに利用可能であるが、ラットに対してはまだ開発されておらず、主にラット乳腺幹細胞^25、26、27に対して選択する抗体の入手可能性の欠如のためである。それにもかかわらず、単分散乳上皮細胞の移植は、再入可能な可能性を定量するためには成功し、それらの細胞は適切なフレームワーク^2、3、4に移植すると正常に発達する。オルガノイドは多くの目的に適しているが、単分散細胞は定量的用途に必要であり、例えば、イオン化放射線治療²⁸の後の癌開始に必要な乳腺上皮細胞の数を決定するか、または細胞学的に選択されたリンパ球上皮細胞集団²⁹のフローの特性を比較する。

現在までに、ここで説明されている手順は、乳腺の発達と乳癌の発達の根底にあるメカニズムを研究するという全体的な目標を持つラットで乳腺移植を行う最も堅牢な方法である。多くの場合、ドナーおよび/またはレシピエント動物は、上皮移植の前、中、または後に異なる変数にさらされる。例としては、化学発癌^30、放射線28、31、32、宿主/ドナーゲノム¹⁸の遺伝子操作、およびホルモン操作¹²を含む単一遺伝子研究が含まれる。本プロトコルに記載されている酵素解離の主な利点は、フローサイトメトリー、3D培養、遺伝子編集などを伴う相補的実験のために上皮オルガノイドまたは単分散細胞を単離する機会である。この技術の将来の応用には、遺伝子工学によるドナーおよび/または宿主組織の追加操作が含まれる。例えば、ドナー細胞はCRISPR−Cas9遺伝子編集システムを用いて選択されたゲノム遺伝子座において、任意のゲノム座座において遺伝的に改変され得る。同様に、レシピエントラットは、ドナーとレシピエントの遺伝子因子の相互作用を研究するために遺伝子的に改変することもできる。

Protocol

すべての動物はAAALAC認可施設に収容され、維持され、このプロトコルに記載された実験は、MUSC機関動物保護および使用委員会(IACUC)によって承認されました。相互移植に使用する動物は近親交配または等原性株であるべきであり、少なくとも6世代のコンジェニック状態が好ましいまたは後方交差する。 1. ドナーラット乳腺上皮の収穫 移植に必要なドナーラットの…

Representative Results

ドナーとレシピエント乳腺移植用ラット乳腺上皮細胞を単離して調製するステップを図1Aに示す。生後4週齢では、ドナーラットの内因性乳腺が成熟を開始し、上皮は、ミョウバンカルミンで染色された全ての取り付けスライド上で可視化することができる(図1B)。</stro…

Discussion

このプロトコルは、ラットを操作するために最適化された乳腺上皮細胞移植技術を記述する。ドナーラットから単離された乳腺上皮オルガノイド(3〜5週齢)は、レシピエントラットの間肩膜白色脂肪パッド(また3〜5週齢)に移植される。結果は、わずか4〜6週間後に、移植された組織を調べるために軽顕微鏡を使用して解釈することができる。しかし、移植と犠牲の間の最適な時間は、完全な実…

Materials

0.2 µM syringe filters	Fisher Scientific	09-715G	sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile)	Fisher Scientific	05-408-129	containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers	Corning	431752	filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles	Hamilton	81001 & 90525	For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette	–	–	transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube	Falcon (Corning)	352196	brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers	Corning	431750	filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes	Fisher Scientific	05-539-6	for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes	Thermo Scientific	130181	for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate	Sigma-Aldrich	243361/237086	staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use	–	–	follow institutional protocol
Beta-dine or iodine	–	–
Borosilicate glass culture tube for homogenization	Fisher Scientific	14-961-26	for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine	Sigma-Aldrich	C6152/1022	staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus	–	–
Clean animal cages for recovery	–	–	follow institutional protocol
Collagenase Type 3	Worthington Biochemical Corp.	LS004183	enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water	–	–	for chemical solutions
DMEM/F12	GIBCO	11320033	for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA	–	–	monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2705/2701	mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	–	inactivation solution
Gauze	–	–
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-212	use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS	GIBCO	–	monodispersion mixture
Heating pads	–	–	follow institutional protocol
Ice buckets (x2)	–	–
Incubator with orbital rotation	–	–	must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia	–	–	follow institutional protocol
Light microscope or digital camera	–	–	visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer	Fisher Scientific	–	TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure	Sigma-Aldrich/ ACROS Organics	8042-47-5	long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer	–	–	follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes	–	–
Positively-charged microscope slides	Thermo Scientific	P4981-001	mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic	–	–	Institutional protocol
Scale			body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver	–	–	electric clippers, or other
Staining jars	–	–	minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes	IMCO	4410-IMC	used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved)	–	–	autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater)	–	–	for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin	Worthington		monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated)	–	–
Wound clip applier, clips, and removal tool	Fine Science Tools	12020-00	Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes	Fisher Scientific	X3S-4	clearing mammary gland whole mount slides after staining