Profilering ubiquitin och ubiquitin-liknande beroende post-translationella modifieringar och identifiering av betydande förändringar

Summary

Detta protokoll syftar till att upprätta ubiquitin (UB) och ubiquitin-likes (ubls) specifika proteom för att identifiera förändringar av denna typ av posttranslationella modifieringar (ptms), associerade med ett specifikt tillstånd såsom en behandling eller en fenotyp.

Abstract

Ubiquitin (UB) och ubiquitin-liknande (UBL) beroende post-translationella modifieringar av proteiner spelar grundläggande biologiska reglerande roller i cellen genom att kontrollera protein stabilitet, aktivitet, interaktioner, och intracellulär lokalisering. De gör det möjligt för cellen att reagera på signaler och att anpassa sig till förändringar i sin omgivning. Förändringar inom dessa mekanismer kan leda till svåra patologiska situationer såsom neurodegenerativa sjukdomar och cancer. Syftet med den teknik som beskrivs här är att etablera UB/ubls beroende PTMs profiler, snabbt och korrekt, från odlade cellinjer. Jämförelsen av olika profiler som erhålls från olika förhållanden gör det möjligt att identifiera specifika förändringar, såsom de som induceras av exempelvis en behandling. Lentiviral medierad celltransduktion utförs för att skapa stabila cellinjer som uttrycker en två-Tags (6His och flagga) version av modifieraren (ubiquitin eller en UBL som SUMO1 eller Nedd8). Dessa taggar tillåter rening av ubiquitin och därför av och proteiner från cellerna. Detta görs genom en två-stegs reningsprocess: den första utförs i denatureringsförhållanden med hjälp av 6His tagg, och den andra i inhemska förhållanden med hjälp av flaggan taggen. Detta leder till en mycket specifik och ren isolering av modifierade proteiner som därefter identifieras och semikvantifieras genom vätskekromatografi följt av tandem-masspektrometri (LC-MS/MS)-teknik. Enkel informatikanalys av MS-data med Excel-programvara gör det möjligt att etablera PTM-profiler genom att eliminera bakgrunds signaler. Dessa profiler jämförs mellan varje villkor för att identifiera specifika förändringar som sedan kommer att studeras mer specifikt, börjar med deras validering av vanliga biokemiska tekniker.

Introduction

Den metod som föreslås här är tillägnad studera PTMs förmedlas av ubiquitin familjemedlemmar från odlade däggdjursceller för att identifiera potentiella förändringar i samband med ett visst tillstånd (behandling, differentiering, etc). PTMs representerar det sista steget i regleringen av proteiners funktioner¹. Faktum är att en gång produceras av translationella maskiner, de flesta om inte alla proteiner genomgår olika typer av PTMs som modulera sin verksamhet, molekylära interaktioner, och intracellulära plats¹. Bland de överflöd av PTMs är de som förmedlas av ubiquitin familjen av proteiner, ubiquitin själv och alla ubiquitin-likes, har potential att reglera alla intracellulära eller delvis cytoplasmiska proteiner². Eftersom de själva är proteiner, de kan konjugeras till varandra, bildar homogena och heterogena kedjor av olika topologier, varje associerad med specifika reglerande funktioner². Verktyg behövs för att försöka dechiffrera och förstå denna komplexa maskiner. Många metoder har utvecklats över hela världen, med sina egna fördelar och nackdelar, och här föreslår vi en med hög prestanda som lämpar sig för odlade celler.

Den största fördelen med denna metod är dess noggrannhet. Faktum är att renheten av isolerade modifierade proteiner är mycket bättre genom den kombinatoriska användningen av de två taggarna (6his och flagga) och de två steg-förfarande och därför är det mycket mer selektiv än en enda tagg fusion UB/UBL^3,4. Närvaron av 6his tag möjliggör ett första steg i rening i ett helt denaturerande tillstånd därigenom undvika någon samrening av proteiner som innehåller ubiquitin bindande domäner eller andra proteiner som binder till de och sådana. Detta är ett tekniskt problem som uppstått på grund av flera andra tillvägagångssätt som bygger på affinitetsrening av ubiquitinerade proteomer med antingen specifika antikroppar⁵ eller tandem-bindningselement (rör)⁶. Viktigare är denna teknik inte partisk till förmån för rening av en viss typ av ubiquitination, eftersom det kan vara fallet för vissa andra metoder, eftersom både mono och olika typer av polyubiquitinations identifierades⁷. Följaktligen, en gång funnit, en förändring av ubiquitination kommer att behöva studeras i mer detaljer genom standard biokemiska metoder för att identifiera den exakta typen av ubiquitination inblandade.

Slutligen, en annan teknisk fördel med detta protokoll är användningen av lentivirus, som lätt och snabbt skapar stabila uttrycker cellinjer med rimlig nivå av uttryck för taggade modifierare utan att störa den normala cellulära beteende.

Medan en viktig roll ubiquitination är att rikta proteiner för proteasomen nedbrytning, är det nu känt att det har många andra reglerande egenskaper för potentiellt de flesta intracellulära eller delvis intracellulära proteiner¹. Numrera av dessa fungerar förstärks vidare av existensen av många ubiquitin lika proteiner som bildar en familj av proteiner som reglerar nästan varje cellmekanism¹. Deras förändringar kan få drastiska effekter på cellbiologi och kan leda eller delta i patologiska situationer⁸, såsom cancer⁹. Därför behövs verktyg för att utforska detta vidsträckta landskap och identifiera de förändringar som är förknippade med ett sjukdomstillstånd som kan fungera som nya terapeutiska mål.

Detta protokoll är tillägnad celler i kulturen eftersom de måste vara sensorik att uttrycka exogena taggade UB/UBL. När de har skapats kan dessa stabila cellinjer användas för att generera UBL-profiler från kulturen i 2D eller 3D eller xenografts, vilket utökar horisonten för de olika experimentella modellerna som kan användas för att studera PTMs-profiler.

Protocol

1. generering av stabila cellinjer uttrycker 6His-flagga-UBL Obs: Co-transfektion av HEK-293T celler med pCCL-6HF-UBL, pVSVG och delta-Helper. Dag 0: Seed 293t celler i en 6-brunn tallrik för att få 50-70% sammanflödet dagen efter. Dag 1: Co-transfect 50-70% konfluenta celler med en blandning av 1 μg pccl-6hf-UBL eller pccl-GFP, 1 μg pvsvg och 1 μg delta-Helper vektorer, med hjälp av en transfektion reagens och protokoll för lentivirus produktion. Efter 6 h av trans…

Representative Results

Transduktion av kultur däggdjursceller för att skapa GFP och 6HF-UB som uttrycker cellerFör att producera lentivirus som kommer att användas senare för att transduce miapaca-2 celler, 70% konfluenta hek-293t celler Co-transfected med en lika stor del av de tre vektorer, pccl-6hf-ubiquitin eller GFP/delta-Helper/pvsvg. Efter 24 h produktion, mediet innehållande lentivirala partiklar återvinns och filtreras. Det är möjligt på denna punkt att kontrollera effekt…

Discussion

Vi har utvecklat en robust och tillförlitlig metodik för att generera profiler av proteiner som modifierats av de viktigaste ubiquitin familjemedlemmarna. I själva verket har vi framgångsrikt tillämpat detta protokoll för att generera profiler av PTMs av ubiquitin, och även av SUMO och Nedd8, och för att upptäcka förändringar i samband med en behandling⁷, som svar på över uttryck eller knockdown av en viss gen (data inte som visats) och i celler som förvärvat en resistent fenotyp ti…

Materials

ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag