Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen
Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.
Abstract
Ubiquitin (ub) und ubiquitin-like (ubl) abhängige posttranslationale Modifikationen von Proteinen spielen grundlegende biologische regulatorische Rollen innerhalb der Zelle, indem sie Proteinstabilität, Aktivität, Wechselwirkungen und intrazelluläre Lokalisation kontrollieren. Sie ermöglichen es der Zelle, auf Signale zu reagieren und sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Veränderungen innerhalb dieser Mechanismen können zu schweren pathologischen Situationen wie neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs führen. Ziel der hier beschriebenen Technik ist es, ub/ubls abhängige PTMs-Profile schnell und genau aus kultivierten Zelllinien zu erstellen. Der Vergleich verschiedener Profile, die unter verschiedenen Bedingungen gewonnen werden, ermöglicht die Identifizierung spezifischer Veränderungen, wie sie z. B. durch eine Behandlung induziert werden. Lentivirale, vermittelte Zelltransduktion wird durchgeführt, um stabile Zelllinien zu erzeugen, die eine Zwei-Tags-Version (6His und Flag) des Modifikators (Ubiquitin oder ein Ubl wie SUMO1 oder Nedd8) exdrücken. Diese Tags ermöglichen die Reinigung von Ubiquitin und damit von ubiquitinierten Proteinen aus den Zellen. Dies geschieht durch einen zweistufigen Reinigungsprozess: Der erste wird unter Denaturierung von Bedingungen mit dem 6His-Tag und der zweite unter systemeigenen Bedingungen mit dem Flag-Tag durchgeführt. Dies führt zu einer hochspezifischen und reinen Isolierung modifizierter Proteine, die anschließend durch Flüssigchromatographie identifiziert und halbquantifiziert werden, gefolgt von der Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Technologie. Die einfache informatierte Analyse von MS-Daten mit Excel-Software ermöglicht die Erstellung von PTM-Profilen durch eliminierung von Hintergrundsignalen. Diese Profile werden zwischen den einzelnen Bedingungen verglichen, um spezifische Veränderungen zu identifizieren, die dann genauer untersucht werden, beginnend mit ihrer Validierung durch Standard-Biochemie-Techniken.
Introduction
Die hier vorgeschlagene Methode ist der Untersuchung von PTMs gewidmet, die von Ubiquitin-Familienmitgliedern aus kultivierten Säugetierzellen vermittelt werden, um potenzielle Veränderungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Erkrankung (Behandlung, Differenzierung usw.) zu identifizieren. PTM stellen den letzten Schritt der Regulierung der Proteinfunktionendar 1. In der Tat, einmal von der translationalen Maschinerie produziert, die meisten, wenn nicht alle Proteine unterziehen verschiedene Arten von PTMs, die ihre Aktivität, molekulare Wechselwirkungen und intrazelluläre Lagemodulieren 1. Zu den vielen PTMs gehören die, die von der Ubiquitin-Familie von Proteinen vermittelt werden, Ubiquitin selbst und alle Ubiquitin-Likes, haben das Potenzial, alle intrazellulären oder teilweise zytoplasmatischen Proteine zu regulieren2. Da sie selbst Proteine sind, können sie miteinander konjugiert werden und homogene und heterogene Ketten unterschiedlicher Topologien bilden, die jeweils mit spezifischen regulatorischen Funktionen verbunden sind2. Werkzeuge werden benötigt, um zu versuchen, diese komplexe Maschinerie zu entschlüsseln und zu verstehen. Viele Ansätze wurden weltweit entwickelt, mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen, und hier schlagen wir einen mit hoher Leistung für kultivierte Zellen vor.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Genauigkeit. Tatsächlich wird die Reinheit isolierter modifizierter Proteine durch die kombinatorische Verwendung der beiden Tags (6His und Flag) und das Zwei-Stufen-Verfahren erheblich verbessert und ist daher viel selektiver als eine Single-Tag-Fusion Ub/Ubl3,4. Das Vorhandensein des 6His-Tags ermöglicht einen ersten Schritt der Reinigung in einem vollständig denaturierenden Zustand, wodurch jede Ko-Reinigung von Proteinen, die Ubiquitin-bindende Domänen oder andere Proteine enthalten, die an die ubiquitinierten binden, vermieden wird. Dies ist ein technisches Problem, auf das mehrere andere Ansätze stoßen, die auf der Affinitätsreinigung ubiquitinierter Proteome basieren, die entweder spezifische Antikörper5 oder Tandem-Ubiquitin-Bindungselemente (TUBEs)6verwenden. Wichtig ist, dass diese Technik nicht zugunsten der Reinigung einer bestimmten Art von Ubiquitination voreingenommen ist, da es bei einigen anderen Ansätzen der Fall sein könnte, da sowohl Mono- als auch verschiedene Arten von Polyubiquitinationen identifiziert wurden7. Folglich muss, sobald eine Veränderung der Ubiquitination gefunden wurde, durch biochemische Standardansätze genauer untersucht werden, um die genaue Art der Ubiquitination zu ermitteln.
Ein weiterer technischer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Lentiviren, die leicht und schnell stabile zelllösende Zelllinien mit einem angemessenen Ausdrucksgrad des markierten Modifizierers erzeugen, ohne das normale Zellverhalten zu stören.
Während eine wichtige Rolle der Ubiquitination darin besteht, Proteine auf den proteasomalen Abbau auszurichten, ist es inzwischen bekannt, dass sie viele andere regulatorische Eigenschaften für potenziell die meisten intrazellulären oder teilweise intrazellulären Proteine hat1. Die Anzahl dieser Funktionen wird durch die Existenz vieler Ubiquitin-ähnlicher Proteine noch verstärkt, wodurch eine Familie von Proteinen gebildet wird, die fast jeden Zellmechanismus regulieren1. Ihre Veränderungen können drastische Auswirkungen auf die Zellbiologie haben und können zu pathologischen Situationen führen oder daran teilnehmen8, wie Krebs9. Daher sind Werkzeuge erforderlich, um diese weite Landschaft zu erforschen und die Veränderungen zu identifizieren, die mit einem pathologischen Zustand verbunden sind, der als neuartige therapeutische Ziele dienen könnte.
Dieses Protokoll ist Zellen in der Kultur gewidmet, da sie transduziert werden müssen, um exogene markierte Ub/Ubl auszudrücken. Nach der Erstellung können diese stabilen Zelllinien verwendet werden, um Ubl-Profile aus Kultur in 2D- oder 3D- oder Xenografts zu generieren und so den Horizont der verschiedenen experimentellen Modelle zu erweitern, die zum Studium von PTMs-Profilen angewendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine robuste und zuverlässige Methodik entwickelt, um Profile von Proteinen zu generieren, die von den wichtigsten Ubiquitin-Familienmitgliedern modifiziert wurden. In der Tat haben wir dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um Profile von PTMs durch Ubiquitin, aber auch durch SUMO und Nedd8 zu generieren und Veränderungen im Zusammenhang mit einer Behandlung zu erkennen7, als Reaktion auf die Überexpression oder den Knockdown eines bestimmten Gens (Daten nicht und in Zellen, die ei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von La Ligue Contre le Cancer to HV und MS und der ARC (Association pour la recherche sur le cancer) an PS, INCa (institute national du cancer) und Canceropole PACA to JI unterstützt. Die Massenspektrometrieanlage von Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) unterstützt von IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, der Cancéropéle PACA, der Provence-Alpes-Céte d’Azur Région, das Institut Paoli-Calmettes und das Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
Referências
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