Detta protokoll syftar till att upprätta ubiquitin (UB) och ubiquitin-likes (ubls) specifika proteom för att identifiera förändringar av denna typ av posttranslationella modifieringar (ptms), associerade med ett specifikt tillstånd såsom en behandling eller en fenotyp.
Ubiquitin (UB) och ubiquitin-liknande (UBL) beroende post-translationella modifieringar av proteiner spelar grundläggande biologiska reglerande roller i cellen genom att kontrollera protein stabilitet, aktivitet, interaktioner, och intracellulär lokalisering. De gör det möjligt för cellen att reagera på signaler och att anpassa sig till förändringar i sin omgivning. Förändringar inom dessa mekanismer kan leda till svåra patologiska situationer såsom neurodegenerativa sjukdomar och cancer. Syftet med den teknik som beskrivs här är att etablera UB/ubls beroende PTMs profiler, snabbt och korrekt, från odlade cellinjer. Jämförelsen av olika profiler som erhålls från olika förhållanden gör det möjligt att identifiera specifika förändringar, såsom de som induceras av exempelvis en behandling. Lentiviral medierad celltransduktion utförs för att skapa stabila cellinjer som uttrycker en två-Tags (6His och flagga) version av modifieraren (ubiquitin eller en UBL som SUMO1 eller Nedd8). Dessa taggar tillåter rening av ubiquitin och därför av och proteiner från cellerna. Detta görs genom en två-stegs reningsprocess: den första utförs i denatureringsförhållanden med hjälp av 6His tagg, och den andra i inhemska förhållanden med hjälp av flaggan taggen. Detta leder till en mycket specifik och ren isolering av modifierade proteiner som därefter identifieras och semikvantifieras genom vätskekromatografi följt av tandem-masspektrometri (LC-MS/MS)-teknik. Enkel informatikanalys av MS-data med Excel-programvara gör det möjligt att etablera PTM-profiler genom att eliminera bakgrunds signaler. Dessa profiler jämförs mellan varje villkor för att identifiera specifika förändringar som sedan kommer att studeras mer specifikt, börjar med deras validering av vanliga biokemiska tekniker.
Den metod som föreslås här är tillägnad studera PTMs förmedlas av ubiquitin familjemedlemmar från odlade däggdjursceller för att identifiera potentiella förändringar i samband med ett visst tillstånd (behandling, differentiering, etc). PTMs representerar det sista steget i regleringen av proteiners funktioner1. Faktum är att en gång produceras av translationella maskiner, de flesta om inte alla proteiner genomgår olika typer av PTMs som modulera sin verksamhet, molekylära interaktioner, och intracellulära plats1. Bland de överflöd av PTMs är de som förmedlas av ubiquitin familjen av proteiner, ubiquitin själv och alla ubiquitin-likes, har potential att reglera alla intracellulära eller delvis cytoplasmiska proteiner2. Eftersom de själva är proteiner, de kan konjugeras till varandra, bildar homogena och heterogena kedjor av olika topologier, varje associerad med specifika reglerande funktioner2. Verktyg behövs för att försöka dechiffrera och förstå denna komplexa maskiner. Många metoder har utvecklats över hela världen, med sina egna fördelar och nackdelar, och här föreslår vi en med hög prestanda som lämpar sig för odlade celler.
Den största fördelen med denna metod är dess noggrannhet. Faktum är att renheten av isolerade modifierade proteiner är mycket bättre genom den kombinatoriska användningen av de två taggarna (6his och flagga) och de två steg-förfarande och därför är det mycket mer selektiv än en enda tagg fusion UB/UBL3,4. Närvaron av 6his tag möjliggör ett första steg i rening i ett helt denaturerande tillstånd därigenom undvika någon samrening av proteiner som innehåller ubiquitin bindande domäner eller andra proteiner som binder till de och sådana. Detta är ett tekniskt problem som uppstått på grund av flera andra tillvägagångssätt som bygger på affinitetsrening av ubiquitinerade proteomer med antingen specifika antikroppar5 eller tandem-bindningselement (rör)6. Viktigare är denna teknik inte partisk till förmån för rening av en viss typ av ubiquitination, eftersom det kan vara fallet för vissa andra metoder, eftersom både mono och olika typer av polyubiquitinations identifierades7. Följaktligen, en gång funnit, en förändring av ubiquitination kommer att behöva studeras i mer detaljer genom standard biokemiska metoder för att identifiera den exakta typen av ubiquitination inblandade.
Slutligen, en annan teknisk fördel med detta protokoll är användningen av lentivirus, som lätt och snabbt skapar stabila uttrycker cellinjer med rimlig nivå av uttryck för taggade modifierare utan att störa den normala cellulära beteende.
Medan en viktig roll ubiquitination är att rikta proteiner för proteasomen nedbrytning, är det nu känt att det har många andra reglerande egenskaper för potentiellt de flesta intracellulära eller delvis intracellulära proteiner1. Numrera av dessa fungerar förstärks vidare av existensen av många ubiquitin lika proteiner som bildar en familj av proteiner som reglerar nästan varje cellmekanism1. Deras förändringar kan få drastiska effekter på cellbiologi och kan leda eller delta i patologiska situationer8, såsom cancer9. Därför behövs verktyg för att utforska detta vidsträckta landskap och identifiera de förändringar som är förknippade med ett sjukdomstillstånd som kan fungera som nya terapeutiska mål.
Detta protokoll är tillägnad celler i kulturen eftersom de måste vara sensorik att uttrycka exogena taggade UB/UBL. När de har skapats kan dessa stabila cellinjer användas för att generera UBL-profiler från kulturen i 2D eller 3D eller xenografts, vilket utökar horisonten för de olika experimentella modellerna som kan användas för att studera PTMs-profiler.
Vi har utvecklat en robust och tillförlitlig metodik för att generera profiler av proteiner som modifierats av de viktigaste ubiquitin familjemedlemmarna. I själva verket har vi framgångsrikt tillämpat detta protokoll för att generera profiler av PTMs av ubiquitin, och även av SUMO och Nedd8, och för att upptäcka förändringar i samband med en behandling7, som svar på över uttryck eller knockdown av en viss gen (data inte som visats) och i celler som förvärvat en resistent fenotyp ti…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av La Ligue contre le cancer till HV och MS, och ARC (Association pour la Recherche sur le cancer) till PS, INCa (Institute National du cancer) och Canceropole PACA till JI. Masspektrometrianläggningen i Marseille proteomik (marseille-proteomique.univ-amu.fr) med stöd av IBISA (infrastrukturer biologie santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d’Azur Région, institut Paoli-Calmettes och Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |